流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用課件

流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用2012.11婁全博流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對懸浮液中的細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行快速測量和多參數(shù)檢測的細(xì)胞分析技術(shù)，是上世紀(jì)70年代在單細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細(xì)胞理化特性，諸如大小、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進(jìn)行快速測量并分類收集的高科技技術(shù)。它綜合了激光技術(shù)，計算機(jī)技術(shù)，流體力學(xué)，細(xì)胞化學(xué)，單克隆抗體，熒光化學(xué)，分子生物學(xué)等各門學(xué)科，在對細(xì)胞群體的亞群進(jìn)行定量分析時，具有其它手段無法比擬的優(yōu)越性。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用臨床型光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學(xué)易掌握流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用科研型

同時配備多種波長的激光器，并可快速的將感興趣的細(xì)胞分選到特定的培養(yǎng)孔上，適用于廣泛且靈活的科研應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用流式細(xì)胞儀基本組成結(jié)構(gòu)1.流動室和液流系統(tǒng)（流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)）2.光學(xué)系統(tǒng)（激光光源和光束形成、收集系統(tǒng)）3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用噴嘴激光液鞘流動室內(nèi)充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流環(huán)包，鞘液流是一種穩(wěn)定的液體流動，鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統(tǒng)運行中流速是不變的，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學(xué)聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，并且保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用流式細(xì)胞儀光信號流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用1、散射光信號：FSC和SSC

前向散射光信號(FSC)：與激光束方向同軸的稱前向散射光信號，反映細(xì)胞大小激光器激光器接收器大顆粒小顆粒流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用側(cè)向散射光信號(SSC)：與激光束方向垂直的稱為側(cè)向散射光信號，主要反映了細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC信號越強(qiáng)，反映細(xì)胞內(nèi)顆粒性。激光器接收器流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用散射光信號不依賴任何樣品的制備技術(shù)（如染色），因此稱為細(xì)胞的物理參數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測的樣本種類多樣(單細(xì)胞懸濁液)(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺液，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、細(xì)胞裂解液流式細(xì)胞儀特點及檢測標(biāo)本流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用樣品制備1、新鮮或冰凍實體組織：酶消化法、機(jī)械法、化學(xué)試劑處理法等。剪碎法：取新鮮或冰凍（浸泡于生理鹽水中）實體組織0.5cm3，眼科手術(shù)剪剪碎，加入生理鹽水，300目尼龍膜過濾，200ml離心5min，生理鹽水洗滌二次。注意事項：由于各種實體組織成份、特性各不相同，對不同的實體組織必須采用不同的單細(xì)胞分散方法，才能使單細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞損傷小。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用2、石蠟包埋組織：擴(kuò)大了FCM分析應(yīng)用范圍，并可以對大量臨床隨訪病例資料進(jìn)行重新研究與利用。標(biāo)體制備：①二甲苯脫蠟法②組織清潔劑脫蠟法③甲酸雙氧水處理法。注意事項：①脫蠟完全：檢驗方法加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，即可視為脫凈，反之則沒有脫凈。②掌握消化時間，避免細(xì)胞核消化掉。③切片薄厚適宜，過薄組織碎片多，過厚不宜脫蠟。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用3、骨髓、血液及體液：去除紅細(xì)胞及濃縮有核細(xì)胞。①骨髓及血液：淋巴細(xì)胞分離液②體液：一般需經(jīng)300ml離心5min，PBS洗滌二次。如體液中紅細(xì)胞太多，可用溶血素去除紅細(xì)胞。注意事項：①每次同時制備對照血液淋巴細(xì)胞標(biāo)本，作為二倍體細(xì)胞外參標(biāo)準(zhǔn)。②視標(biāo)本中有核細(xì)胞濃度的高低進(jìn)行調(diào)整，一般細(xì)胞濃度調(diào)至5~10X109/L。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用熒光染色PBS洗細(xì)胞1~2次加（熒光）單抗，暗處孵育15~30分鐘PBS洗細(xì)胞一次過300目尼龍網(wǎng)上機(jī)檢測流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用通過DNA檢測進(jìn)行細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期：G0、G1、S、G2、M細(xì)胞周期中DNA含量：G0/G1--2C（二倍體）S期--2C→4C、G2/M-4C（四倍體）流式細(xì)胞周期與DNA倍體分析的基本原理流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用4CM期：

細(xì)胞分裂期4CG2期：DNA合成后期2C-4CS期：

DNA合成期2CG1期：DNA合成前期2CG0期：DNA合成靜止期DNA倍體細(xì)胞周期：流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用FCM分析細(xì)胞周期的基本方法DNA熒光染料特異性與細(xì)胞DNA結(jié)合DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與DNA所吸收熒光分子多少成正比。最常用的熒光染料：碘化丙啶（PI）流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用DNA含量的表示細(xì)胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指數(shù)（DNAindex，DI)表示相對含量，一個正常的二倍體細(xì)胞峰，其G0/G1期細(xì)胞DNA含量為2C，DI值為1.0。DI=（樣本G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)）/（正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)）DI=樣本G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用DNA倍體的判定標(biāo)準(zhǔn)二倍體的DI為1.0，四倍體的DI為2.0。變異系數(shù)（CV）：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞CV≤3%，新鮮組織標(biāo)本CV≤5%。對于一個正常人體的二倍體細(xì)胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M細(xì)胞占10-15%以下。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用以二倍體參考細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞DNA含量定為2C值DI=1.0，基于標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞的CV在5%以下，即判定標(biāo)準(zhǔn)：DNA二倍體=2C+2CV，DNA異倍體不等于2C+2CV。1.DI=1.0±0.1(0.9~1.10)為二倍體。2.DI=1.0±0.15(0.85~1.15)為近二倍體。3.DI=2.0±0.1(1.90~2.10)為四倍體。4.DI>2.10為多倍體5.其余DI均為異倍體。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用FCM分析在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標(biāo)志，有助于癌變的早期診斷。淋巴瘤在病理形態(tài)學(xué)還不能作出診斷前，F(xiàn)CM倍體分析可以提供準(zhǔn)確的診斷信息。DNA非整倍體的交界瘤應(yīng)按惡性腫瘤對待。形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示有惡變的可能。DI可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用FCM分析DNA含量和DNA倍體的預(yù)后意義通常認(rèn)為DNA含量高，非整倍體的腫瘤惡性程度高，預(yù)后差，二倍體或近二倍體腫瘤預(yù)后好。除DI及倍體外，反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的S期細(xì)胞比例也被作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用FCM分析在腫瘤脫落細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用(1)發(fā)現(xiàn)DNA非整倍體細(xì)胞峰診斷為癌。(2)如無明顯的非整倍體細(xì)胞峰，但有一個突出的四倍體細(xì)胞峰和>15%的超二倍體細(xì)胞（S期細(xì)胞），并伴有G0/G1峰的CV>9%，診斷為癌。(3)無明顯的非整倍體細(xì)胞峰，但G0/G1峰CV值增大，并伴有>10%~15%超二倍體細(xì)胞和一個突出的四倍體峰，診斷為可疑癌。流式細(xì)胞術(shù)原理及與腫瘤學(xué)的相關(guān)應(yīng)用為治療方案和藥理學(xué)研究提供依據(jù)

不同類型的腫瘤對化療藥物的敏感性不同?？衫肍CM進(jìn)行細(xì)胞周期分析，適當(dāng)選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。MDR是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白（P-gp）親脂化合物，包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。從人淋巴細(xì)胞排除熒光染料與細(xì)胞