流式細胞術課件

應用分類1、膜表面抗原和胞漿內蛋白分析2、DNA含量及細胞周期分析3、定量分析4、細胞功能分析5、凋亡研究6、細胞間相互左右7、細胞分選流式細胞術1.檢測淋巴細胞亞群，監(jiān)測細胞免疫狀態(tài)2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關系4.干祖細胞的定量及成分分析.5.其它:粘附分子;TCR多態(tài)性檢測;腫瘤癌基因及抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測;細胞內酶;耐藥蛋白的分析等等。流式細胞術

臨床應用疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)免疫調節(jié)：細胞因子/受體的相互作用共刺激分子受體/配體的相互作用

發(fā)病機理：腫瘤的發(fā)病與機體的免疫力低下、以及信號傳遞障礙有關藥物/疫苗效果的評價：腫瘤生物治療的時機選擇、以及效果的監(jiān)測免疫狀態(tài)評價：移植、放化療等.流式細胞術細胞周期分析:在細胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標記DNA，并由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細胞周期分析流式細胞術G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle流式細胞術1.腫瘤的早期診斷。2.腫瘤的良惡性判斷。3.觀察細胞的增殖狀態(tài)及周期分布。4.療效監(jiān)測流式細胞術細胞功能分析

1.吞噬功能試驗

2.氧爆發(fā)試驗3.根據(jù)T淋巴細胞分泌細胞因子的不同將CD4+或CD8+分為介導細胞免疫的I型細胞和介導體液免疫的II型細胞.4.藥物泵的功能檢測

5.NK細胞的腫瘤殺傷活性檢測6.血小板的粘附,聚集功能檢測流式細胞術樹突狀細胞分析（DendriticCells,DC)DC是主要的抗原遞呈細胞，同時又是重要的先天免疫細胞，還是具有免疫調控功能的一個細胞群，沒有發(fā)現(xiàn)特異性的抗原標記DC研究的主要內容包括直接分析計數(shù)、體外誘導檢測,一般分為兩群－PDC,MDC當前DC檢測的方法：1）Lin-,CD11c,CD123,同時可能表達CD80,CD86,CD83,DR等2）利用BDCA1,2,3,4對外周血或其它組織DC進行分析3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123流式細胞術T細胞分析相對計數(shù)－淋巴細胞亞群數(shù)量檢查項目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正?；蛟龈呓档徒档湍[瘤降低降低增高降低降低流式細胞術CD4細胞絕對計數(shù)對AIDS病人的診斷、療效和預后有重要的指導意義，一般認為CUTOFF值為200/ul.絕對計數(shù)是加入濃度已知的標準微球與標本一起測定，流式細胞儀控制軟件在設置后能自動計算出濃度對任何細胞群體都可以進行絕對計數(shù)流式細胞術Th1Th2細胞因子分泌細胞測定根據(jù)產(chǎn)生的細胞因子的類型和生物學功能,人的ＣＤ4+Ｔ細胞可以分為Ｔｈ1、Ｔｈ2Ｔｈ1細胞產(chǎn)生ＩＬ2、ＩＬ12、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ等細胞因子,主要參與細胞介導的免疫反應、遲發(fā)性過敏反應,并在清除病毒等細胞內致病因子方面起著重要作用Ｔｈ2細胞分泌ＩＬ4、ＩＬ5、ＩＬ6、ＩＬ10、ＩＬ13等細胞因子,主要促進體液免疫反應,中和胞外病原體相應地，CD8+T細胞也可以分為Tc1和Tc2Th1細胞：介導細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導遲發(fā)型過敏反應。其功能亢進將導致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細胞：介導體液免疫，促進B細胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉換因子，其功能亢進將導致特異性過敏反應，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。流式細胞術Th1Th2檢測Tips一定要確定T細胞是否已經(jīng)活化，細胞轉運阻滯是否成功，胞膜打孔是否有效流式細胞術一定要用胞漿內同型對照（特別是FITC標記時），以便分別部分弱表達的細胞因子。流式細胞術TETRAMER抗原遞呈細胞（APC）攜帶抗原片段通過與TCR復合物結合，在APC和T細胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T細胞并產(chǎn)生細胞免疫效應。MHC-四聚體染色技術用于抗原特異性T細胞分析的原理在于體外模仿上述抗原遞呈的過程來實現(xiàn)對特異性T細胞的鑒定，通過流式細胞儀這種高通量分析儀器對標本中這群細胞進行分析

四聚體技術的優(yōu)勢是：可以對特異性免疫細胞進行定量；用流式細胞儀檢測可以快速測定大量細胞，可以同時進行其它表面染色，可以直接用外周血測定而不需要培養(yǎng)；四聚體染色不會殺傷細胞，因此染色后的細胞可以進行分選或其它功能分析；四聚體對所有的特異性T細胞都能夠結合，而不僅僅是對有功能的細胞進行檢測。不同廠家的MHC四聚體產(chǎn)品不太一樣：貝克曼庫爾特公司創(chuàng)造性地構建和表達了MHC分子α3鏈的區(qū)域突變的蛋白（iTAg），能降低其與非特異性T細胞結合，大大提高了特異性。并且將MHC四聚體直接標記熒光，和常用的抗原多肽負載后整體商品化，也有單獨的MHC分子（iTAg）單獨出售，極大方便了研究者流式細胞術流式細胞術CD4CD25Treg調控性T細胞的主要功能是抑制機體免疫功能，太強則免疫耐受，太弱會引起自身免疫反應調控性T細胞調節(jié)抗原遞呈細胞對抗原的遞呈調控性T細胞的表型是CD4+CD25bright，逐漸發(fā)現(xiàn)越來越多的其它分子可能能夠更精確限定（eg.FOX-1?)CD25也是免疫細胞晚期活化的標記，但表達的平均熒光強度不足夠強流式細胞術非特異性的先天免疫細胞δＴ細胞:占外周血T細胞的10％以下，非抗原依賴型免疫細胞，在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加，表達CD3量較普通T細胞多NK細胞：占外周血淋巴細胞8－25％，傳染病和腫瘤病人數(shù)量偏低。NK細胞可以根據(jù)NKR的不同而分類，丙型肝炎的發(fā)生和預后可能與NK細胞的表型相關DC：分布與淋巴組織和外周血，為非成熟狀態(tài)，遇到相應的抗原后主要分泌IFN-alpha來發(fā)揮左右流式細胞術其它重要分子的流式分析的意義粘附分子：物種間高度保守，與細胞間通訊，干細胞HOMING，腫瘤的發(fā)生可能有很重要的關系，如CD11C/CD18-CD54與DC成熟和遷移有關；CD209-CD102與抗原遞呈有關CD26:移植后造血干細胞表達可能不利于該細胞的homing，有證據(jù)表明抑制造血干細胞有利用移植成功流式細胞術流式細胞術在移植中的應用移植配型和群體反應性抗體的檢測熒光示蹤標記的移植細胞：CFSE是一個確定的熒光標記物，開發(fā)其它穩(wěn)定的熒光素應該更有幫助流式細胞術流式細胞儀分選為達到最高的分選效率，實用中最好先用磁珠分選系統(tǒng)進行初步分選活細胞分選非常有用流式細胞術流式細胞術在生物醫(yī)學研究的新方向細胞多態(tài)性分析：受體、抗原折疊、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(與AIDS易感性有關），NKR(中國科大研究領先項目）信號傳導（實際主要為胞漿內磷酸化及去磷酸化蛋白的檢測）新型熒光特異性探針：胞內病原體檢測、轉錄因子檢測、細胞器或細胞生命活動指標的新熒光素的應用利用分選的細胞進行體內和體外功能研究與其它定位性的熒光設備聯(lián)合使用（如MPE,CONFOCAL,IC100等）流式細胞術CellLabIC100C