《雙向凝膠電泳》課件

《雙向凝膠電泳》本課程將介紹雙向凝膠電泳的基本原理、方法、步驟、應(yīng)用、優(yōu)勢和缺陷，并提供一些實驗技巧和案例分析。讓我們深入探索這種強大的蛋白質(zhì)組學技術(shù)。課程目標了解雙向凝膠電泳的原理掌握雙向凝膠電泳的基本原理，包括等電聚焦和SDS。熟悉雙向凝膠電泳的方法學習雙向凝膠電泳的具體步驟，包括樣品預(yù)處理、膠制備、電泳分離和染色分析。掌握雙向凝膠電泳的應(yīng)用了解雙向凝膠電泳在蛋白質(zhì)組學研究中的應(yīng)用，例如蛋白質(zhì)表達譜分析、蛋白質(zhì)差異表達分析等。電泳基本原理電泳電泳是利用帶電粒子在電場中的遷移速度不同，實現(xiàn)分離和分析的一種技術(shù)。等電聚焦基于蛋白質(zhì)等電點不同進行分離，等電點是指蛋白質(zhì)在某一pH值時，其凈電荷為零。SDS基于蛋白質(zhì)分子量不同進行分離，SDS是一種陰離子表面活性劑，可以使蛋白質(zhì)帶上負電荷，并使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開。雙向凝膠電泳方法1樣品預(yù)處理2第一向分離（等電聚焦）3第二向分離（SDS）4染色與分析雙向凝膠電泳步驟1樣品預(yù)處理包括蛋白質(zhì)提取、定量、脫鹽和還原等步驟。2第一向分離在等電聚焦膠中進行，將蛋白質(zhì)按等電點進行分離。3第二向分離在SDS膠中進行，將蛋白質(zhì)按分子量進行分離。4染色與分析用合適的染色方法對蛋白質(zhì)進行染色，并用圖像分析軟件進行分析。樣品預(yù)處理蛋白質(zhì)提取從生物樣品中提取蛋白質(zhì)，方法包括裂解、超聲波處理、勻漿等。蛋白質(zhì)定量測定蛋白質(zhì)濃度，常用方法有BCA法、Bradford法、Lowry法等。蛋白質(zhì)脫鹽去除樣品中的鹽離子，常用方法有透析、超濾等。蛋白質(zhì)還原斷裂蛋白質(zhì)中的二硫鍵，常用還原劑為β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇。第一向分離1制備等電聚焦膠使用含有非離子型去污劑的等電聚焦膠，如IPG膠。2上樣將樣品上樣到等電聚焦膠的樣品槽中。3等電聚焦在電場中進行等電聚焦，蛋白質(zhì)遷移至其等電點位置。4固定和平衡在等電聚焦結(jié)束后，固定蛋白質(zhì)，并用含有SDS的緩沖液平衡蛋白質(zhì)。第二向分離制備SDS膠使用含有SDS的聚丙烯酰胺凝膠，常用濃度為10%或12%。上樣將等電聚焦后的膠條上樣到SDS膠的樣品槽中。SDS電泳在電場中進行SDS電泳，蛋白質(zhì)遷移至其分子量位置。固定和染色在電泳結(jié)束后，固定蛋白質(zhì)，并用合適的染色方法進行染色。染色與分析染色方法常用染色方法包括考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色等，選擇合適的染色方法取決于實驗?zāi)康暮偷鞍踪|(zhì)豐度。圖像掃描使用凝膠掃描儀掃描染色后的凝膠，獲得數(shù)字圖像。圖像分析使用圖像分析軟件對圖像進行分析，識別和量化蛋白質(zhì)點，并進行差異表達分析。雙向凝膠電泳儀器設(shè)備雙向凝膠電泳儀用于進行等電聚焦和SDS電泳，提供穩(wěn)定的電源和溫度控制。電泳槽用于放置等電聚焦膠和SDS膠，并進行電泳分離。凝膠掃描儀用于掃描染色后的凝膠，獲得數(shù)字圖像。實驗試劑及配制1蛋白質(zhì)提取試劑例如RIPA裂解液、Tris緩沖液等。2蛋白質(zhì)定量試劑例如BCA試劑盒、Bradford試劑盒等。3等電聚焦試劑例如IPG膠、等電聚焦緩沖液等。4SDS試劑例如聚丙烯酰胺單體、SDS緩沖液、染色液等。第一向膠的制備選擇合適的IPG膠根據(jù)蛋白質(zhì)等電點范圍選擇合適的IPG膠，例如pH3-10、pH4-7等。制備等電聚焦緩沖液按照比例配制等電聚焦緩沖液，通常包含非離子型去污劑、兩性電解質(zhì)等。澆鑄IPG膠將等電聚焦緩沖液和IPG膠倒入電泳槽中，并進行凝固。第二向膠的制備1制備分離膠將聚丙烯酰胺單體、SDS緩沖液、TEMED和過硫酸銨按照比例混合，倒入電泳槽中，并進行凝固。2制備濃縮膠將聚丙烯酰胺單體、SDS緩沖液、TEMED和過硫酸銨按照比例混合，倒入電泳槽中，并進行凝固。3準備上樣孔在濃縮膠上制作樣品上樣孔。等電聚焦條件1電壓通常從低電壓開始，逐漸增加電壓，最終達到所需的電壓。2電流電流逐漸減小，直至達到穩(wěn)定狀態(tài)。3時間等電聚焦時間取決于蛋白質(zhì)等電點范圍、IPG膠的長度和電壓等因素。4溫度控制溫度在合適的范圍內(nèi)，以確保蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和膠的完整性。SDS條件電壓通常設(shè)置為恒定電壓，例如100V。電流電流逐漸減小，直至達到穩(wěn)定狀態(tài)。時間SDS電泳時間取決于蛋白質(zhì)分子量范圍、膠的長度和電壓等因素。溫度控制溫度在合適的范圍內(nèi)，以確保蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和膠的完整性。樣品上樣等電聚焦上樣將樣品上樣到等電聚焦膠的樣品槽中。SDS上樣將等電聚焦后的膠條上樣到SDS膠的樣品槽中。電泳分離等電聚焦在電場中進行等電聚焦，蛋白質(zhì)遷移至其等電點位置。SDS在電場中進行SDS電泳，蛋白質(zhì)遷移至其分子量位置。膠片染色考馬斯亮藍染色常用的染色方法，可以使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)藍色。銀染靈敏度較高的染色方法，可以使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)黑色。熒光染色靈敏度高，可以進行定量分析，常用方法包括SYPRORuby染色等。圖像掃描與分析1圖像掃描使用凝膠掃描儀掃描染色后的凝膠，獲得數(shù)字圖像。2圖像分析使用圖像分析軟件對圖像進行分析，識別和量化蛋白質(zhì)點。3差異表達分析對不同組樣品的蛋白質(zhì)點進行比較，識別差異表達蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)分析處理蛋白質(zhì)點匹配將不同組樣品的蛋白質(zhì)點進行匹配，以確保比較的是同一蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)點定量對蛋白質(zhì)點進行定量分析，獲得蛋白質(zhì)豐度信息。差異表達分析識別差異表達蛋白質(zhì)，并進行統(tǒng)計分析。雙向電泳應(yīng)用1蛋白質(zhì)組學研究用于分析蛋白質(zhì)表達譜，識別差異表達蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)的功能。2疾病診斷用于檢測疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，輔助疾病診斷和治療。3藥物研發(fā)用于篩選藥物靶點，評估藥物療效。4食品安全檢測用于檢測食品中的有害物質(zhì)，例如細菌毒素、農(nóng)藥殘留等。雙向凝膠電泳優(yōu)勢高通量可以同時分析大量的蛋白質(zhì)。高分辨率可以分離出等電點和分子量非常接近的蛋白質(zhì)。靈敏度高可以檢測到微量的蛋白質(zhì)?？芍貜托院脤嶒灲Y(jié)果可重復性較高。雙向凝膠電泳缺陷技術(shù)復雜操作步驟較多，需要熟練的操作技巧。數(shù)據(jù)分析復雜需要專業(yè)的圖像分析軟件和數(shù)據(jù)處理方法。無法分析所有蛋白質(zhì)只能分析可溶性蛋白質(zhì)，無法分析膜蛋白等。蛋白質(zhì)降解問題蛋白質(zhì)降解會導致實驗結(jié)果不準確。實驗中常見問題膠不均勻可能是膠制備過程中操作不當造成的，例如混合不均勻、溫度控制不當?shù)?。蛋白質(zhì)點模糊可能是樣品預(yù)處理不當、等電聚焦或SDS電泳條件不合適造成的。蛋白質(zhì)點丟失可能是蛋白質(zhì)降解、上樣量不足或電泳過程中蛋白質(zhì)遷移過快造成的。實驗中的注意事項操作規(guī)范嚴格按照實驗操作步驟進行，避免人為誤差。儀器設(shè)備維護定期維護儀器設(shè)備，確保其正常工作。實驗記錄詳細記錄實驗步驟、參數(shù)和結(jié)果，以便追溯和分析。典型實驗結(jié)果展示疑難解答1膠不均勻檢查膠制備過程，確?；旌暇鶆?、溫度控制合適。2蛋白質(zhì)點模糊優(yōu)化樣品預(yù)處理、等電聚焦和SDS電泳條件。3蛋白質(zhì)點丟失檢查樣品是否降解、上樣量是否足夠、電泳條件是否合適。總結(jié)回顧雙向凝膠電泳原理等電聚焦和SDS，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量進行分離。雙向凝膠電泳步驟樣品預(yù)處理、膠制備、電泳分離和染色分析。雙向凝膠電泳應(yīng)用蛋白質(zhì)組學研究、疾病診斷、藥物研發(fā)、食品安全檢測等。雙向凝膠電泳優(yōu)勢與缺陷高通量、高分辨率、靈敏度高，但技術(shù)復雜、數(shù)據(jù)分析復雜。參考文獻雙向凝膠電泳技術(shù)及其應(yīng)用.生物技術(shù)通報，2010，26(2):1-5.雙向凝膠電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組學研究中的應(yīng)用.中國科學