過(guò)氧化氫酶（CAT）活性分析試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性分析試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理過(guò)氧化氫酶（Catalase,CAT,EC）是一種常見(jiàn)的抗氧化酶，可催化過(guò)氧化氫（H2O2）分解為水和氧，普遍存在于含有細(xì)胞色素系統(tǒng)的好氧細(xì)胞中。過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞是高度有害的，其積累將導(dǎo)致細(xì)胞靶標(biāo)（例如DNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)）的氧化，從而導(dǎo)致誘變和細(xì)胞死亡。通過(guò)使用過(guò)氧化氫酶從細(xì)胞中去除過(guò)氧化氫（H2O2），可以防止細(xì)胞的氧化損傷。過(guò)氧化氫酶在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中的作用已被廣泛研究。過(guò)氧化氫酶還表現(xiàn)出過(guò)氧化活性，其中低分子量醇可用作電子供體。脂肪醇是過(guò)氧化氫酶的特異性底物，然而，具有過(guò)氧化活性的其它酶不利用這些底物。CheKine?過(guò)氧化氫酶(CAT)活性分析試劑盒（微量法），提供了一種簡(jiǎn)單易用的微量法，用于分析不同生物樣品（血清、血漿、細(xì)胞/組織裂解液、生物液體）中過(guò)氧化氫酶活性。該檢測(cè)試劑盒利用過(guò)氧化氫酶的過(guò)氧化物酶功能來(lái)測(cè)定過(guò)氧化氫酶的活性。在合適濃度的H2O2存在的條件下，過(guò)氧化氫酶與甲醇反應(yīng)，產(chǎn)生甲醛，生成的甲醛可以與顯色物反應(yīng)，產(chǎn)物可以在540nm處測(cè)量吸光度，樣本中的過(guò)氧化氫酶活性與OD值成正比。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見(jiàn)光分光光度計(jì)（能測(cè)540nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·水浴鍋，離心機(jī)·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備1×AssayBuffer:AssayBuffer(10×)用去離子水稀釋至1×AssayBuffer。取2mLAssayBuffer(10×)加入18mL去離子水稀釋至1×AssayBuffer，可在4℃保存至少兩個(gè)月。1×SampleDiluent:SampleDiluent(10×)用去離子水稀釋至1×SampleDiluent。取5mLSampleDiluent(10×)加入45mL去離子水稀釋至1×SampleDiluent，可用來(lái)稀釋FormaldehydeStandards，Catalase(Control)和樣本，可在4℃保存至少兩個(gè)月。1×LysisBuffer:Lysisbuffer(10×)用去離子水稀釋至1×LysisBuffer。取5mLLysisbuffer(10×)加入45mL去離子水稀釋至1×LysisBuffer，可在4℃保存至少兩個(gè)月。Methanol:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。FormaldehydeStandard:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：FormaldehydeStandard有毒性，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)佩戴口罩手套等防護(hù)措施。DilutedCatalase(Control):該瓶含有牛肝臟CAT粉末，作為陽(yáng)性對(duì)照。用0.5mL1×SampleDiluent復(fù)溶并混合（復(fù)溶的酶可在-20℃保存一個(gè)月）。取10μL已經(jīng)復(fù)溶的酶，用4.99mL1×SampleDiluent工作液稀釋（稀釋的酶可4℃保存30min）。PotassiumHydroxide:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。DilutedHydrogenPeroxide:用9.96mL去離子水稀釋40μLHydrogenPeroxide。DilutedHydrogenPeroxide可于冰上保存2h。Chromogen:即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃避光保存。PotassiumPeriodate:即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：PotassiumPeriodate具有強(qiáng)氧化性，與可燃物料接觸可能引起火災(zāi)。標(biāo)準(zhǔn)品制備：用9.99mL1×SampleDiluent稀釋10μLFormaldehydeStandard，得到4.25mM的儲(chǔ)存液。按下表所示，進(jìn)一步稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。StandardFormaldehyde(μL)1×SampleDiluent(μL)FinalConcentration(μMFormaldehyde)1499622109905330970154609403059091045612088060715085075注意：Finalformaldehydeconcentration是指在170μL反應(yīng)體系里的終濃度。樣本制備動(dòng)植物組織：稱取0.1g組織加入1mL預(yù)冷的1×Lysisbuffer將樣本進(jìn)行勻漿。勻漿后的樣本，10,000g，4℃離心15min，取上清液做進(jìn)一步分析。細(xì)胞：收集5×106個(gè)細(xì)胞加入1mL預(yù)冷的1×Lysisbuffer，冰上勻漿，10,000g，4℃離心15min，取上清液做進(jìn)一步分析。血清、血漿：按常規(guī)方法收集血清，1×SampleDiluent稀釋后即可作為血清樣本進(jìn)行檢測(cè)；用抗凝管收集血液，顛倒混勻。600g，4℃離心10min，移取上清至另一新的離心管中，適量1×SampleDiluent稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。處理好的樣本須當(dāng)天檢測(cè)。測(cè)定過(guò)程中樣本在冰上放置，以免變性和失活。如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見(jiàn)光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，可見(jiàn)光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：試劑 空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測(cè)定孔（μL）陽(yáng)性對(duì)照孔（μL）1×AssayBuffer100100100100Methanol303030301×SampleDiluent20000Stds02000Sample00200DilutedCatalase(Control)00020DilutedHydrogenPeroxide20202020充分混勻，室溫孵育20minPotassiumHydroxide30303030Chromogen30303030充分混勻，室溫孵育10minPotassiumPeriodate10101010充分混勻，室溫孵育5min，立即測(cè)定540nm處的吸光值A(chǔ)。計(jì)算ΔA測(cè)=A測(cè)定-A空白，ΔA標(biāo)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.001可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于0.8，樣本可用1×SampleDiluent進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以標(biāo)準(zhǔn)溶液Finalformaldehydeconcentration(μM)為y軸，ΔA標(biāo)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度為y軸更方便計(jì)算結(jié)果）。根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣本產(chǎn)生的甲醛濃度Formaldehyde(μM)=y×(0.17mL÷0.02mL)=8.5×y再計(jì)算CAT的酶活，1個(gè)酶活單位定義為：25℃環(huán)境下，每分鐘產(chǎn)生1.0nmol甲醛的酶的量按樣本蛋白濃度計(jì)算CATActivity=μMofSample÷(20min)÷Cpr×Sampledilution=0.425×y÷Cpr×Sampledilution(nmol/min/mgprot)按液體體積計(jì)算CATActivity=μMofSample÷(20min)×Sampledilution=0.425×y×Sampledilution(nmol/min/mL)按樣本鮮重計(jì)算CATActivity=μMofSample÷(20min)÷W×Sampledilution=0.425×y÷W×Sampledilution(nmol/min/g)細(xì)胞數(shù)量計(jì)算CATActivity=μMofSample÷(20min)÷cellsnumber×Sampledilution=0.425×y÷500×Sampledilution(nmol/min/104cells)W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。Formaldehyde(μForma