脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測試劑盒實驗解決方案

脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理脂肪酸合成酶（FAS）是脂肪酸合成的關鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達于各種組織細胞中，在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達豐富。CheKine?脂肪酸合成酶（FAS）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測生物體內FAS活性，其原理是：FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，計算FAS活性。自備耗材·酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調節(jié)式移液槍及槍頭·制冰機、低溫離心機、水浴鍋·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；用前一天取出置于4℃充分解凍后混勻，平衡到室溫；-20℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：AssayBuffer有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個人防護。WorkingNADPH：臨用前96T加入1.968mLAssayBuffer，48T加入0.984mLAssayBuffer，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復凍融。WorkingAcetylCoA：臨用前96T加入0.528mLAssayBuffer，48T加入0.264mLAssayBuffer，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復凍融。WorkingMalonylCoA：臨用前96T加入1.008mLAssayBuffer，48T加入0.504mLAssayBuffer，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存2周，禁止反復凍融。工作液的配制：每孔配制180μL工作液：吸取16μLWorkingNADPH，4μLWorkingAcetylCoA，8μLWorkingMalonylCoA和152μLAssayBuffer。工作液需現配現用，根據需要測定的樣本數按比例配制。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。1.動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心40min，取上清液，置冰上待測。2.植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴超聲波破碎細胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），12,000g，4℃離心40min，取上清液，置冰上待測。3.細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），12,000g，4℃離心40min，取上清液，置冰上待測。4.血清（漿）等液體樣本：直接測定。注意：對于脂肪含量較高的動物組織，離心后移除上層脂肪，再取上清液。如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質濃度測定。實驗步驟1.酶標儀或紫外分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長到340nm。紫外分光光度計用去離子水調零。2.恒溫箱預熱到37℃，工作液置于恒溫箱中預熱15min以上。3.在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL樣本和180μL工作液，迅速混勻，測定340nm處吸光值。記錄第10s和70s時吸光值，分別記錄為A1和A2。ΔA測=A1-A2。注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.0005可適當加大樣本量。如果ΔA大于0.4，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋（計算結果乘以稀釋倍數），或減少提取用樣本量。結果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。A.使用96孔UV板測定的計算公式1.按照蛋白濃度計算活性單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmolNADPH為1個酶活單位。FAS酶活(U/mgprot)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T×n=3,216×ΔA測÷Cpr×n2.按照樣本質量計算活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmolNADPH為1個酶活單位。FAS酶活(U/g鮮重)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T×n=3,216×ΔA測÷W×n3.按細胞或細菌數量計算活性單位定義：每104個細胞或細菌每分鐘氧化1nmolNADPH為1個酶活單位。FAS酶活(U/104)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞或細菌數量×V樣÷V樣總)÷T×n=3,216×ΔA測÷500×n=6.432×ΔA測×n4.按液體體積計算活性單位定義：每mL樣本每分鐘氧化1nmolNADPH為1個酶活單位。FAS酶活(U/mL)=(ΔA測÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T×n=3,216×ΔA測×nε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積，L，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；V樣：加入上清液體積，0.02mL；T：反應時間，1min；n：樣本稀釋倍數；W：樣品質量，g；V樣總：提取液體積，1mL；500：細胞總數，500萬。B.使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中的光徑d:0.5cm調整為d:1cm進行計算即可。結果展示FAS(FAS(U/g)Figure1.小鼠腦、小鼠脾臟和玉米種子中的FAS活性。相關產品CatalogNo.ProductNameKTB2210Che