生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)pbl-神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF有關(guān)技術(shù)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF董偉東楊曄王一帆黃聰2017/11/8目錄1.神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的活性測(cè)定方法；2.NGF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定技術(shù)；3.NGF跨過BBB的關(guān)鍵技術(shù)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF定義：神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。NGF包含α、β、γ三個(gè)亞單位，活性區(qū)是β亞單位，由兩個(gè)118個(gè)氨基酸組成的單鏈通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成的二聚體，與人體NGF的結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，生物效應(yīng)也無明顯的種間特異性。

α亞基功能尚不清楚（紅色）

γ亞基具有蛋白酶活性（綠色）

β亞基具有生物活性的NGF（藍(lán)色）研究歷程1953年意大利科學(xué)家Levi-Montalcini發(fā)現(xiàn)了NGF。1960年美國(guó)科學(xué)家Cohen提取純化NGF，證明其生物活性。1970年Cohen證明NGF是個(gè)復(fù)合蛋白。1984年NGF的研究重點(diǎn)從周圍神經(jīng)系統(tǒng)拓展到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，乃至非神經(jīng)系統(tǒng)。1986年Montalcini和Cohen因?qū)GF研究的杰出而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。90年代國(guó)內(nèi)外多家制藥公司和藥物研究機(jī)構(gòu)相繼開始進(jìn)行NGF開發(fā)研究。2001年北京圣日醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司第一個(gè)獲得中國(guó)SDA頒發(fā)NGF新藥證書。2002年武漢海特生物制藥股份有限公司和北京圣日合作開始了NGF產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。2003年1月6日世界上第一個(gè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子——金路捷在武漢海特上市。神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的活性測(cè)定方法1.雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法；2.PC12細(xì)胞培養(yǎng)法；3.高內(nèi)涵技術(shù)測(cè)定NGF4.TF1細(xì)胞增殖法；1.雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法原理：7-10日齡雞胚背根節(jié)(DRG)接種在涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿上，加入NGF培養(yǎng)，光鏡下測(cè)微尺測(cè)定直徑(半定量)；條件的選擇：1.用“-，o，△，+，++，+++”表示神經(jīng)節(jié)的長(zhǎng)勢(shì)：由弱到強(qiáng)；2.綜合實(shí)驗(yàn)所得，應(yīng)選擇DMEM為培養(yǎng)液，在15%雞胚浸液和20%雞血漿，用伊莎褐雞胚腰部背根神經(jīng)節(jié)，加入蛇毒NGF，并使其濃度為30ng/ml條件下培養(yǎng)36h后觀察結(jié)果較為顯著。2.PC12細(xì)胞培養(yǎng)法原理：NGF引起PC12細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)，通過測(cè)量或者觀察神經(jīng)突起的數(shù)目和長(zhǎng)度，從而得出NGF的活性。條件：15%的小牛血清+85%的1640培養(yǎng)基設(shè)立三組，第一組為不加NGF，第二組為加NGF，第三組為加NGF及其抑制劑A為第一組，B為第二組，C為第三組定性分析條件：取適量生長(zhǎng)良好PC12細(xì)胞,接種于盛有10mL的定性測(cè)定培養(yǎng)液(85%RPMI1640,15%小牛血清)的培養(yǎng)瓶中,分別加入樣品或?qū)φ盏纳睇}水,37℃培養(yǎng),每3～4d換1次培養(yǎng)液。結(jié)果：10d后對(duì)照組的細(xì)胞仍呈球形,有活性的實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞分化出神經(jīng)樣的突觸。定量分析條件：取致敏細(xì)胞適量,接種于有10mL定量測(cè)定培養(yǎng)液(85%RPMI1640,12%小牛血清,3%熱滅活馬血清)的培養(yǎng)瓶中,加入不同濃度的樣品或生理鹽水,37℃培養(yǎng)24h,結(jié)果：于顯微鏡下觀察,隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野,每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)10個(gè)細(xì)胞團(tuán),明顯長(zhǎng)出突觸的細(xì)胞團(tuán)記為活性細(xì)胞團(tuán)。根據(jù)定義(1mL活性測(cè)定培養(yǎng)液中,促進(jìn)產(chǎn)生50%活性細(xì)胞團(tuán)的NGF量定義為1個(gè)活性單位)算出活性單位數(shù)。3.用高內(nèi)涵技術(shù)測(cè)定NGF原理：應(yīng)用具有高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)檢測(cè)指標(biāo)多元化和功能化的篩選技術(shù)，可以通過觀察神經(jīng)節(jié)的長(zhǎng)勢(shì)來評(píng)價(jià)NGF的活性。條件：用PC12細(xì)胞。

高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)的組成

1．熒光顯微系統(tǒng)許多化合物只能引起細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞器形態(tài)和分子分布等微弱的改變，因此必須使用高分辨率的熒光顯微系統(tǒng)才能夠檢測(cè)出來。細(xì)胞與熒光標(biāo)記物結(jié)合后，其生理狀態(tài)的改變即可被熒光顯微系統(tǒng)的熒光探針捕獲。

2．自動(dòng)化熒光圖像獲取系統(tǒng)在觀察到熒光標(biāo)記的細(xì)胞變化后，可用高分辨率CCD相機(jī)將圖像拍攝下來。自動(dòng)化熒光圖像獲取系統(tǒng)可快速并精確地移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板或載玻片，自由轉(zhuǎn)換各種波長(zhǎng)的激光及散射濾光片以滿足多種研究需要。若同步使用激光共聚焦技術(shù)則可以與多種細(xì)胞培養(yǎng)板匹配，在較短時(shí)間內(nèi)完成96孔板或384孔板樣品分析。另外，還可添加溫度控制系統(tǒng)以維持細(xì)胞活性，以及添加自動(dòng)加樣系統(tǒng)和白光系統(tǒng)等。

3．檢測(cè)儀器觀察并獲取圖像只是高內(nèi)涵篩選技術(shù)的第一步，為了有效完成分析工作，必須利用檢測(cè)儀器從圖像中提取有價(jià)值的信息。目前，一些公司開發(fā)了應(yīng)用變化終點(diǎn)檢測(cè)和動(dòng)態(tài)活細(xì)胞檢測(cè)相結(jié)合分析方法的檢測(cè)儀器以拓展檢測(cè)范圍。代表性的是美國(guó)Cellomics公司開發(fā)出的ArrayScanHCSReader和KineticScanTMHCSReader等。4．圖像處理分析軟件隨著高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)的升級(jí)，需要一種新型的高內(nèi)涵篩選軟件簡(jiǎn)化和自動(dòng)化其操作,從而更加準(zhǔn)確地測(cè)定基于形態(tài)學(xué)和熒光標(biāo)記的細(xì)胞特征參數(shù)。例如Cellomics公司開發(fā)的BioApplication軟件可將多種來源的圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信息，包括來自熒光檢測(cè)、激光共聚焦、掃描流式細(xì)胞檢測(cè)及其他高內(nèi)涵篩選檢測(cè)儀器的圖像數(shù)據(jù)。

5．結(jié)果分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)上述應(yīng)用軟件可用于追蹤分析多種細(xì)胞變化過程，如信號(hào)分子轉(zhuǎn)位、受體內(nèi)源化、鈣離子化、酶活化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及神經(jīng)突觸生長(zhǎng)等，通過分析個(gè)體和群體細(xì)胞水平的多種特征獲取有意義的生物信息。數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)用來儲(chǔ)存和管理已獲取的圖像和定量分析結(jié)果，并能夠?qū)⑦@些結(jié)果以圖像、表格等多種形式在個(gè)體和群體細(xì)胞水平輸出，使研究人員能夠系統(tǒng)地進(jìn)行總結(jié)并作出決策。4.TF1細(xì)胞增殖法原理：TF1是一種GM-CSF依賴性的人紅系白血病細(xì)胞，在無GM-CSF存在下，不能正常增殖。但由于其表面表達(dá)TrkA（NGF受體），NGF能夠與其結(jié)合，誘導(dǎo)TF1增殖，通過MTT法測(cè)量TF1細(xì)胞的量從而得出NGF的活性。條件：1.mNGF的濃度確定：mNGF起始濃度為500AU/ml，倍比稀釋，培養(yǎng)24h，TF1增殖曲線表明高濃度的mNGF會(huì)抑制TF1增殖，最佳起始作用濃度為100AU/ml，最佳濃度范圍為0.1-100AU/ml2.細(xì)胞沉淀分別用1640清洗次數(shù)的確定；3.細(xì)胞密度的確定；細(xì)胞沉淀用5ml1640清洗3次，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度mNGF作用的細(xì)胞狀態(tài)也很差，嘗試只清洗2次，高濃度mNGF組細(xì)胞狀態(tài)良好

4.mNGF作用下48h和72h條件的選擇各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)TF1的優(yōu)點(diǎn)：TF1細(xì)胞易于培養(yǎng)，且比較穩(wěn)定，培養(yǎng)多代細(xì)胞都不會(huì)出現(xiàn)變異。目前已培養(yǎng)20代以上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)mNGF反應(yīng)性良好。NGF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定技術(shù)NGF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路簡(jiǎn)介TrkA受體P75受體NGF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定技術(shù)1.蛋白免疫印跡法（Westernblot）2.ELISANGF細(xì)胞信號(hào)通路NGF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定技術(shù)1.Westernblot

TrkA

AKT

ERK(磷酸化水平)1.Westernblot

TrkA

AKT

c-Raf

ERKCREB(磷酸化水平)NGF細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定技術(shù)2.ELISASolidBlack96-wellplatesRatspecificcaptureantibodyTissuehomogenateRabbitdetectionantibodyWashedwithTBSTGoatanti-rabbitalkalinephosphataseWashedwithTBST2.ELISAAlkalinephosphataseCDP-starsubstrate關(guān)于血腦屏障與NGF：1.除大小在400~600間的脂溶性小分子團(tuán)外，血液循環(huán)中的藥物不能透過血腦屏障，且通過血流進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物達(dá)不到有效劑量。2.在靜脈給藥后，NGF這一陰離子分子在血流中會(huì)被迅速清除。對(duì)NGF分子重構(gòu)的目標(biāo)：1.增加NGF透過血腦屏障的量；2.延長(zhǎng)NGF在血漿中的存留時(shí)間。NGF透過血腦屏障的關(guān)鍵技術(shù)1.脂質(zhì)體技術(shù)；2.嵌合肽技術(shù)；3.PEG技術(shù)。關(guān)鍵技術(shù)一——脂質(zhì)體技術(shù)

脂質(zhì)體是將藥物包封人脂質(zhì)雙分子層形成的超微型球體，是天然或合成脂質(zhì)在水中再分散時(shí)形成的脂質(zhì)雙分子層膜小泡。脂質(zhì)體具有生物可適性、生物可降解性、無毒和無免疫源性。關(guān)鍵技術(shù)一——脂質(zhì)體技術(shù)存在的問題：脂質(zhì)體，甚至小單層脂質(zhì)體也不能在缺乏載體介導(dǎo)的情況下將藥物明顯地轉(zhuǎn)運(yùn)透過血腦屏障。由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細(xì)胞的攝取，導(dǎo)致靜脈給藥的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)在血流中被快速清除。關(guān)鍵技術(shù)一——脂質(zhì)體技術(shù)問題的解決：與嵌合肽技術(shù)、PEG技術(shù)聯(lián)用。關(guān)鍵技術(shù)二——嵌合肽技術(shù)

將正常情況下不能透過血腦屏障的藥物連接到血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)載體上，形成嵌合肽，即具有雙功能的共軛化合物，它不僅能透過血腦屏障，而且能保持來自連接藥物的藥學(xué)功能。雙硫鍵：通過一個(gè)裂解開的雙硫鍵有希望將藥物連接上一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)載體，藥物從轉(zhuǎn)運(yùn)載體上釋放下來后仍保持藥學(xué)活性。關(guān)鍵技術(shù)三——PEG技術(shù)

聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積，能改變藥物在水溶液中的生物分配行為和溶解性，在其修飾的藥物周圍產(chǎn)生空間屏障，減少藥物的酶解，避免在腎臟的代謝中很快被消除，并使藥物能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)別。關(guān)鍵技術(shù)三——PEG技術(shù)相對(duì)于雙硫鍵，PEG提供比較長(zhǎng)的連接鍵，包含連接鍵的原子數(shù)目從l4增加到100。連接載體與藥物的這個(gè)長(zhǎng)序列臂的存在沒有產(chǎn)生任何障礙，而且藥物與受體的連接沒有受到損害。參考文獻(xiàn)[1]黃玉輝，徐天瑞，龔毅.雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性的條件

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