《HPLC法測(cè)定五味子中五味子醇甲的含量實(shí)證探究》5800字

IIHPLC法測(cè)定五味子中五味子醇甲的含量實(shí)證研究目錄摘要 I第1章前言 1第2章實(shí)驗(yàn)部分 31.儀器與試劑 32.方法與結(jié)果 42.1色譜條件 42.2對(duì)照品溶液的制備 42.3五味子藥材的預(yù)處理 52.4五味子藥材的制備 52.5線(xiàn)性關(guān)系考察 52.6精密度試驗(yàn) 52.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 62.8重復(fù)性試驗(yàn) 62.9回收率試驗(yàn) 62.10含量測(cè)定 6第3章結(jié)果與分析 73.1線(xiàn)性關(guān)系考察 73.2精密度試驗(yàn) 73.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 73.4重復(fù)性試驗(yàn) 73.5回收率試驗(yàn) 73.6含量測(cè)定 8第4章討論 9第5章結(jié)論 10參考文獻(xiàn) 11摘要目的：以五味子為研究對(duì)象，用高效液相色譜對(duì)五味子醇甲進(jìn)行含量測(cè)定。方法：高效液相色譜采用的色譜條件：色譜柱采用Shim-packGIST柱（4.6×150mm，5m，SHIMADZU），流動(dòng)相采用0.1%甲酸水-甲醇（35:65,v/v），檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，流速為1.0mL/min，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：五味子中五味子甲醇能夠較好的分離，五味子醇甲的保留時(shí)間約為6.5min。五味子醇甲線(xiàn)性濃度范圍5～200μg/ml（r=0.9999），平均回收率為100.1%，結(jié)論：采用高效液相色譜的方法操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度高。通過(guò)對(duì)五味子醇甲進(jìn)行含量測(cè)定，有助于五味子相關(guān)質(zhì)量控制研究?！娟P(guān)鍵詞】五味子；五味子醇甲：含量測(cè)定；高效液相色譜第1章前言五味子屬木蘭科干燥成熟的灌木果實(shí),又名為木藥子或五味子。在2005版的《中國(guó)藥典》中,第一次明確有了南方東五味子和北方南五味子的中文名稱(chēng)。南方北五味子主要廣泛分布長(zhǎng)江以南,四川等原產(chǎn)地,北方南五味子主要廣泛分布于長(zhǎng)江以北、東北三省等地。現(xiàn)在華南五味子植物種子的人工繁殖種植方法已經(jīng)逐漸開(kāi)始轉(zhuǎn)為采用人工繁殖種植和利用人工繁殖促進(jìn)等多種種植方法，除了種植的五味子以外,還有野生的五味子，野生華南五味子產(chǎn)于分布較為廣泛的華南地區(qū),在伊春地區(qū)等原生地【1】。五味子藥材無(wú)論是從成分還是從品種都十分的復(fù)雜,在傳統(tǒng)的中藥中,五味子可以用來(lái)補(bǔ)氣,解表散寒,溫肺化飲,近年來(lái)五味子還可以用來(lái)治療乙,均獲得較好的療效【2】。總的來(lái)說(shuō)五味子對(duì)于心血管系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)方面的預(yù)防與治療都具有很好的療效，對(duì)于具有很好的保護(hù)作用，在抵抗炎癥方面也可以使用，它的木脂類(lèi)成分能夠降低低Th2細(xì)胞相關(guān)IL-4、IL-5和IgE的水平從而減輕一些炎癥【3】。北和南五味子主要生長(zhǎng)在自然的生態(tài)環(huán)境中,由于它是近些年來(lái)由于人們對(duì)自然生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞,導(dǎo)致了南五味子的藥物產(chǎn)量在逐年有所減少,為了不斷擴(kuò)大這種藥物的采收來(lái)源,有科學(xué)文獻(xiàn)對(duì)北和南五味子除了果實(shí)之外的植物藤莖、果柄、葉的植物化學(xué)成分和植物藥理活性都對(duì)此進(jìn)行了深入研究【4-6】。木脂素類(lèi)藥物中的甲基五味子醛和醇甲等在所有五味子醇甲中都可測(cè)到,還有機(jī)酸類(lèi)例如甲基檸檬酸、酒石酸、蘋(píng)果酸等,此外，還含有揮發(fā)油等有效成分,不同成分療效也不同【7-10】。五味子是一種可以作為藥材也可以作為食物的植物。五味子膠囊中的一種木脂素類(lèi)似物是一種脂溶性很好的化學(xué)物質(zhì),所以常常將作為五味子的有效組成部位的木脂提取物混合制作膠囊成五味軟膠囊,做成制劑可以很好的被人體吸收,起到較好的療效。在食物上也十分受歡迎,可以用五味子制作成飲料、釀酒、制作成保健品等,另外,五味子的果實(shí)營(yíng)養(yǎng)也十分的豐富。對(duì)于五味子不同的加工方法自然對(duì)五味子的有效成分的影響也會(huì)有所不同【11】。五味子廣泛應(yīng)用于我國(guó)臨床上,無(wú)論是在傳統(tǒng)西醫(yī)上還是在現(xiàn)代中醫(yī)上,既然我們選擇這些五味子適合用藥,就要充分考慮它的治療效果怎么樣,由于這些五味子中的成分復(fù)雜,所以我們就需要對(duì)這些五味子進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)它的成分進(jìn)行藥物炮制,常見(jiàn)的藥物炮制用藥方法主要分為有兩種,一種方法是藥物醋制,醋制所可能產(chǎn)生的主要成分為少量醋酸和五味子,醋制藥物可以有效改變一些藥物的理化化學(xué)性質(zhì)以及藥物毒性。還有一種方法是利用酒釀清蒸,將新鮮五味子切片放入加熱到溫度適宜的溫水容器中,加入些料酒和鹽拌勻,所產(chǎn)生的成分是酒制五味子。由于各種五味子及其生長(zhǎng)的地理環(huán)境不同,所以每種五味子中可能所含的有效成分的實(shí)際含量也可能會(huì)隨之有所大的不同。2005版的《中國(guó)藥典》論文采用高效液相測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定水性五味子乙醛甲醇對(duì)測(cè)定五味子甲醛進(jìn)行甲醇質(zhì)量?jī)?yōu)化控制,規(guī)定甲醇不得含量少于0.40%。到了2010版的《中國(guó)藥典》對(duì)于北五味子和南五味子中有效成分的含量分別做出了明確的規(guī)定【12-13】。北五味子的臨床療效有很多,1.可以收斂肺氣,又能下攝腎氣,治療腎虛、腰膝無(wú)力、陽(yáng)痿等。2.可以促進(jìn)臟解毒,達(dá)到保護(hù)的效果。3.可以益氣生津,與人參和麥冬配伍,以益氣強(qiáng)陰。4.是可以收斂肺氣,固澀肺氣,中醫(yī)用來(lái)達(dá)到治療咳嗽的目的。五味子苷還具有極高的生物藥用價(jià)值【14】。五味子在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《名醫(yī)別錄》等書(shū)中都已經(jīng)有詳細(xì)記載。有個(gè)實(shí)驗(yàn)是專(zhuān)門(mén)研究五味子對(duì)小白鼠產(chǎn)生的療效,通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子中五味子甲醇對(duì)于小白鼠具有抵抗炎癥的功效,并且能對(duì)小白鼠進(jìn)行免疫治療【15】。五味子中的五味子醇甲能夠減輕小白鼠的腦缺血再灌注損傷【16】，還能夠?qū)w維化進(jìn)行防治【17】。五味子的功效與作用也不斷的增加,五味子藥材中的五味子醇甲等可以治療艾滋病、治療癌癥、以及PAF拮抗等【18】。如今,五味子合劑也在臨床中應(yīng)用十分廣泛。五味子中具有較強(qiáng)的藥理學(xué)活性。通過(guò)對(duì)五味子中五味子醇甲的測(cè)定,為今后的五味子在醫(yī)藥行業(yè)和飲品行業(yè)等提供一定的依據(jù)。第2章實(shí)驗(yàn)部分1.儀器與試劑儀器：本實(shí)驗(yàn)使用的是高效液相色譜儀是由日本島津公司生產(chǎn)的(LC-20AT)；天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)的微型萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW80)；上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的電子天平(FA1104N)；河南金鼐科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的(JHBE-50S)閃式提取器；昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的(KQ-500GVDV)三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器。試劑：北五味子樹(shù)的果實(shí)購(gòu)于吉林市吉林大藥房；上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的五味子醇甲對(duì)照品，純度大于98%，對(duì)照品批號(hào)：Y17M8H31887，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的HPLC級(jí)甲醇：Fisher；無(wú)水乙醇（AR）。圖1五味子醇甲的化學(xué)結(jié)構(gòu)2.方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱主要采用柱式Shim-packGIST柱（4.6×150mm，5m，SHIMADZU），流動(dòng)相采用的溶液是0.1%甲酸水-甲醇（35:65,v/v），通過(guò)對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)的考察，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為250nm較為合適，流速設(shè)置為1.0mL/min，柱溫為35℃，取樣品10μL分析。圖2-1為五味子甲醇對(duì)照品色譜圖，圖2-2為五味子樣品的色譜圖。圖2-1五味子甲醇對(duì)照品色譜圖圖2-2五味子樣品色譜圖2.2對(duì)照品溶液的制備取10mL容量瓶，取適量的五味子醇甲對(duì)照品，用適量的甲醇作為溶劑，定容至容量瓶的刻度線(xiàn)，搖勻，就可得到配置成的含五味子醇甲的對(duì)照品的溶液含量為1.0mg/ml，備用。2.3五味子藥材的預(yù)處理取干燥后的五味子藥材適量于藥材粉碎機(jī)中粉碎，備用。2.4五味子藥材的制備取目數(shù)為40的中藥目篩，把粉碎機(jī)粉碎過(guò)的五味子藥材進(jìn)行再次過(guò)篩，用電子天平儀器進(jìn)行稱(chēng)量，取五味子藥材粉末適量,放置于250ml的具塞錐形瓶，把提取的五味子藥材放入到具塞錐形瓶中，用量筒量取50%的乙醇250ml,，用超聲儀對(duì)提取的五味子藥材進(jìn)行超聲提取，設(shè)置超聲功率為150W,設(shè)置藥材提取后的時(shí)間長(zhǎng)度為0.75h,再次對(duì)五味子的藥材進(jìn)行質(zhì)量稱(chēng)定，搖勻，用一個(gè)玻璃漏斗進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾之后用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，然后把濾液取出作為供試品溶液。2.5線(xiàn)性關(guān)系考察按照“2.2”項(xiàng)下制備五味子醇甲對(duì)照品系列溶液，用甲醇溶液作為溶劑進(jìn)行稀釋配置后制成一系列濃度為5、10、20、50、100、200ug/ml的六個(gè)五味子醇甲對(duì)照品溶液，把每個(gè)五味子醇甲對(duì)照品進(jìn)行移液依次注入到色譜儀的1，2，3，4，5，6號(hào)位中，進(jìn)行測(cè)定，得到6個(gè)不同的五味子醇甲對(duì)照品的峰面積，將每個(gè)五味子醇甲對(duì)照品峰面積作為坐標(biāo)軸的縱坐標(biāo)（Y）,用每個(gè)五味子醇甲對(duì)照品的濃度作為坐標(biāo)軸的橫坐標(biāo)為（X）,計(jì)算其回歸方程。2.6精密度試驗(yàn)用移液槍隨機(jī)吸取五味子甲醇50μg/ml的對(duì)照品適量，把對(duì)照品注入到7號(hào)位中，按照上述的色譜測(cè)定條件進(jìn)行6次進(jìn)樣，得到6個(gè)色譜結(jié)果，記錄6次得到的對(duì)照品的峰面積。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取在上述進(jìn)行預(yù)處理的五味子粉末，用上述“2.2”下的配置方法進(jìn)行配置，得到供試品溶液，用上述“2.1”下的方法色譜條件對(duì)色譜儀進(jìn)行設(shè)置，放在8號(hào)位中，時(shí)間分別為0、2、4、8、12、24h的每個(gè)時(shí)間進(jìn)行六次進(jìn)樣，分別記錄這6個(gè)不同時(shí)間段的峰面積。2.8重復(fù)性試驗(yàn)取五味子藥材平均分成6份，進(jìn)行稱(chēng)量，把藥材放入到具塞錐形瓶中，加入乙醇，制成待測(cè)液，把這6份待測(cè)液分別放在9-14號(hào)位中，進(jìn)樣分析，得到6個(gè)峰面積，代入五味子對(duì)照品的回歸方程得出對(duì)照品濃度，計(jì)算五味子的含量。為4.72mg/g，RSD為1.9%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知方法重復(fù)性良好。2.9回收率試驗(yàn)用電子天平稱(chēng)量三份五味子粉末，分別向這3份樣品加入相當(dāng)于樣品中五味子醇甲的含量為80%、100%、120%的對(duì)照品溶液3份，把它們分別注入到15-17號(hào)瓶位中，進(jìn)行3次進(jìn)樣分析，根據(jù)峰的峰面積計(jì)算五味子醇甲的回收率和RSD。2.10含量測(cè)定取6個(gè)不同批次的五味子藥材，按上述的實(shí)驗(yàn)方法配制成供試品溶液，把供試品溶液依次注入到18-20號(hào)瓶位中，記錄6次的峰面積，根據(jù)峰面積，計(jì)算五味子藥材的含量。結(jié)果與分析3.1線(xiàn)性關(guān)系考察獲得的五味子醇甲的線(xiàn)性回歸方程為Y=2.086×104X–4.1123×103(r=0.9999)，五味子醇甲對(duì)照品溶度在5～200μg/mL范圍內(nèi)的線(xiàn)性關(guān)系比較好。3.2精密度試驗(yàn)計(jì)算6次峰面積的RSD為0.06%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看得出該色譜儀的精密度良好。3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)根據(jù)峰的峰面積計(jì)算6次峰面積的RSD為1.01%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看得出五味子藥材的穩(wěn)定性很好，在24h內(nèi)穩(wěn)定。3.4重復(fù)性試驗(yàn)計(jì)算五味子醇甲含量為4.72mg/g，RSD為1.9%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知方法重復(fù)性良好。3.5回收率試驗(yàn)計(jì)算結(jié)果如表3-1。平均回收率為100.1%，RSD為0.7%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出該方法的準(zhǔn)確性良好。表3-1五味子甲醇的回收率和RSD組分Component樣品中含量/mgContentinsample加入量/mgAdd測(cè)得量/mgMeasure回收率/%RecoveryRSD/%平均值/%Mean五味子醇甲0.04720.03780.0852100.50.7100.10.04720.04720.0945100.20.80.04720.05650.103699.80.73.6含量測(cè)定計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3-2。表3-26批次五味子藥材中五味子醇甲的含量批號(hào)（LotNo.）五味子醇甲/（mg/g）20210014.7920210024.9320210034.6820210044.6920210054.7420210064.76第4章討論本實(shí)驗(yàn)采用了Shim-packGIST（4.6×150mm，5m，SHIMADZU）色譜柱，選用程序洗脫能使五味子醇甲的分離度好，但是，由于我們的雜質(zhì)與主成分相差不大，并且分離度好，所以我們本實(shí)驗(yàn)選用的是等度洗脫。我們流動(dòng)相采用的是0.1%甲酸水-甲醇溶液（35:65,v/v）。柱溫對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，所以在選擇溫度的時(shí)候要恰當(dāng)，我們選擇的是35℃，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出這個(gè)柱溫下分離較好。在2020年版《中國(guó)藥典》中寫(xiě)到，檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm【19】。所以我們?cè)诟咝б合嗌V儀上設(shè)置的波長(zhǎng)為250nm。參考了藥典處理五味子藥材，超聲提取五味子醇甲，用該方法簡(jiǎn)便快捷。有一項(xiàng)研究結(jié)果表明，甲醇提取的樣品色譜圖雜質(zhì)峰較多，與五味子醇甲峰基線(xiàn)分離效果不好【20】。之后發(fā)現(xiàn)乙醇作為提取劑效果更好，同時(shí)在工業(yè)生產(chǎn)中乙醇的價(jià)格便宜并且在使用過(guò)程中比甲醇更加安全，所以我們采用的是用乙醇為提取溶劑。五味子藥材在傳統(tǒng)中醫(yī)和西醫(yī)上廣泛應(yīng)用，有關(guān)研究結(jié)果表明，五味子中有效成分木脂素類(lèi)具有鎮(zhèn)靜催眠的有效作用,但是都是以北五味子作為代表,他們都認(rèn)為北五味子在質(zhì)量上優(yōu)于南五味子,有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,南五味子與北五味子一樣同樣含有木脂素的主要成分五味子醇甲和五味子酯甲【21】。其他醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)也有證據(jù)報(bào)道南五味子和北五味子同樣具有較強(qiáng)的生物藥理學(xué)活性【22-23】。五味子是一種天然藥用美食營(yíng)養(yǎng)兼用的植物。同時(shí)不同原料產(chǎn)地的五味子中的五味子醇甲和木脂素類(lèi)總含量存在明顯差異，可能主要與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境位置與氣候存在很大的關(guān)系。但是五味子存在道地性，需符合藥典規(guī)定。測(cè)定五味子中五味子醇甲的含量，結(jié)果表明五味子醇甲的線(xiàn)性關(guān)系考察、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)結(jié)果良好，五味子醇甲峰的分離效果良好，可保證在臨床用藥過(guò)程中的穩(wěn)定性和安全性，用高效液相的方法，該方法簡(jiǎn)便快捷，以五味子醇甲為測(cè)定指標(biāo)，可以為五味子藥材的質(zhì)量控制提供參考。第5章結(jié)論我們采用高效液相色譜法，實(shí)驗(yàn)方便快速。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們對(duì)五味子樣品和五味子醇甲對(duì)照品都進(jìn)行了進(jìn)樣分析，用色譜儀對(duì)五味子中的五味子醇甲進(jìn)行含量測(cè)定，為今后五味子藥材提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)[1]胥克章.北五味子GAP基地的栽培及管理技術(shù)口.農(nóng)業(yè)與技術(shù)．2006，26(2)：126—128[2]趙景輝,王再幸,趙偉剛,等.高壓脈沖電場(chǎng)法快速提取北五味子中五味子醇甲的工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2011,23(4):755-757.DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2011.04.039.[3]孫靖輝,呂希,王春梅,等.五味子木脂素對(duì)哮喘模型小鼠Th2相關(guān)炎癥因子的影響[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,21(03):325–328.[4]南京中醫(yī)藥大學(xué)．中藥大辭典嗍.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：518．522．琳，何曉霞，趙余慶，等.五味子果柄化學(xué)成分研究[J].中藥材，2009，32(13):1054-1057.[5]金銀萍，焉石，鄭培和，等.五味子根化學(xué)成分研究[J].特產(chǎn)研究，2011，3:56-59.@@[6]魏忠寶，孫成賀.五味子根、藤莖及葉提取物中五味子甲素、乙素的含量測(cè)定[J].特產(chǎn)研究，2009，4:56-58[7]湯臣康．五昧子的化學(xué)成分和藥理研究的新進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，1994，9(6)：278-282．[8]HanekeJL，BurgosRA，lumadaFA．Schisandrachineno8i8Baill[M]．Fitoterapia，1999：70．．451．[9]SongWazhi，XiaoPeigen．Medicinalplantsandli鰣nconstituentsofSchisandrasphermantheraRehd．ctwils[J]．ChinTraditHerbDrugs，1982，13(1)：41-45．[10]TongYu-yi，SongWanzlIi．TheoccurrenceofsomeimporrantlignansinWuweizi(SchisandraChlnensis)anditsAlliedspecies[J]．Acta['harmSin，1983，18(2)：138.142．[11]琦，王龍虎．現(xiàn)代中藥炮制與質(zhì)量控制技術(shù)．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：105．[12]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[s]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社．2010：227—228．[13]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一都)[S]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：197．[14]譚忠謀，楊帆，韋升堅(jiān)．HPLC法測(cè)定消渴靈片中五味子醇甲的含量[J]．中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，20