第二章天然藥物化學(xué)成分的提取分離方法第三節(jié)色譜分離法講解

第二章天然藥物化學(xué)成分的提取分離方法

第三節(jié)色譜分離法課前回顧1.凝膠過濾色譜的原理？2.吸附色譜常用的吸附劑有哪些？3、試述薄層色譜法的操作步驟？教學(xué)目的和要求1、掌握薄層色譜和柱色譜的操作流程和原理2、熟悉薄層色譜和柱色譜點(diǎn)樣時(shí)的注意事項(xiàng)3、了解高相液相的工作原理第三節(jié)色譜分離法一、薄層色譜：（一）定義：薄層色譜法通常指以吸附劑為固定相的一種液相色譜法。即將固定相在玻璃的表面上，試樣點(diǎn)在薄層的一端，流動(dòng)相借毛細(xì)作用經(jīng)固定相,使被分離物質(zhì)展開（二）、基本參數(shù)5比移值（Rf）

Rf=原點(diǎn)至組分點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至流動(dòng)前沿的距離組分A的Rf=a/c

組分B的Rf=b/c（三）、薄層色譜的操作

吸附劑的選擇薄層板的制作展開劑的選擇點(diǎn)樣展開定位與顯色薄層層析的定量測定6(四)、薄層層析用的吸附劑1、常用的薄層層析吸附劑有硅膠、氧化鋁、纖維素、聚酰胺等。2、吸附劑的選擇：首先決定于樣品成分的性質(zhì)，即它們的溶解性、酸堿性、極性以及是否與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)等；其次要考慮吸附劑、載體是否容易得到及其價(jià)格等。7891、薄層板的制作過程層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑均勻地涂在薄層板上，干燥（110℃活化）后即可使用。(五)、薄層板的制作2、薄層板的分類：

（1）、軟板：顆粒之間空隙大，分離的斑點(diǎn)較為擴(kuò)散，缺點(diǎn)是薄層不牢固，展開時(shí)只能選擇近于水平。（2）、硬板：是用粘合劑的濕法制版。特點(diǎn)：薄層牢固，不易脫落。缺點(diǎn)：展開緩慢，斑點(diǎn)集中。10（五）、黏結(jié)劑1、無機(jī)黏結(jié)劑——石膏（硫酸鈣），添加石膏的吸附劑以字母“G”表示。沒有黏結(jié)劑的吸附劑以字母“H”表示。2、有機(jī)黏結(jié)劑——羧甲基纖維素鈉（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特點(diǎn)是薄層強(qiáng)度高、使用方便，但不能用濃硫酸作顯色劑。11（六）、薄層板活化涂布后的薄層先在室溫下陰干，在使用前置適當(dāng)溫度烘烤一定時(shí)間進(jìn)行活化，然后置干燥器中備用。不同薄層活化條件略有不同，如：硅膠110℃1h氧化鋁110℃30min12（七）點(diǎn)樣1、要求配制樣品的溶劑高度揮發(fā)性和盡可能非極性，否則易使斑點(diǎn)擴(kuò)展。2、采用多次點(diǎn)加法，第二次點(diǎn)加時(shí)應(yīng)待前一次點(diǎn)加的溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行。3、點(diǎn)樣量應(yīng)適中，過載會(huì)引起斑點(diǎn)拖尾，分離度變差。2025/2/8134、常用的點(diǎn)樣方式a一般點(diǎn)樣b徑向點(diǎn)樣c條狀點(diǎn)樣d線形小孔點(diǎn)樣e樣品填入溝槽

徑向展開與普通展開的區(qū)別（八）、展開方式1、多次展開——一次展開未達(dá)滿意分離時(shí)，可將薄層板干燥后再次用同一種溶劑展開，可重復(fù)多次，直到混合物分離為止。2、分步展開——混合物性質(zhì)差別較大時(shí)，一種流動(dòng)相不能有效分離時(shí)，可采用不同溶劑依次展開不同距離。2025/2/8163、二維展開——在兩個(gè)垂直的方向上進(jìn)行展開。將樣品點(diǎn)在薄層板的一個(gè)角上，展開適當(dāng)距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90

的方向進(jìn)行展開。2025/2/817原點(diǎn)124、連續(xù)展開——使到達(dá)薄層上緣的溶劑不斷蒸發(fā)，連續(xù)展開以增加展開距離。因無溶劑前沿，需要有個(gè)參照物同時(shí)展開，以計(jì)算相對(duì)保留值。5、離心展開——薄層板以適當(dāng)轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時(shí)，流動(dòng)相以適當(dāng)速率轉(zhuǎn)移到薄層上。該技術(shù)主要用于制備色譜。6、鍥尖技術(shù)——圓形離心展開具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，但需要有一定的儀器裝置。采用鍥尖技術(shù)可以在一般的展開室中進(jìn)行類似展開。2025/2/819薄層被刮掉部分溶劑前沿二、薄層層析中展開劑的選擇

（一）、各種展開劑按其極性不同排序?yàn)椋和闊N<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸20（二）、選擇薄層條件的簡圖

圖2化合物的極性、吸附劑的活度及展開劑極性間的關(guān)系（1）為被分離化合物的極性（2）為吸附劑的活度（3）為展開劑的極性。2122

（三）、展開劑的選擇：

(1)查閱文獻(xiàn)

(2)微型薄層：用小玻片鋪上薄層，用各種經(jīng)初步選擇認(rèn)為可能應(yīng)用的展開劑展開，從而選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑，再用于一般的薄層層析。用微型薄層，節(jié)省材料和時(shí)間。

(3)微量圓環(huán)技術(shù)三、微量圓環(huán)技術(shù)

（一）、原理：

將試樣溶液點(diǎn)點(diǎn)成同樣大小的圓點(diǎn)，用展開劑，加到試樣點(diǎn)中心，讓展開劑自毛細(xì)管中慢慢流出進(jìn)行展開。23

微量圓環(huán)技術(shù)

1用環(huán)己烷展開

2用苯展開

3用氯仿展開（二）、展開時(shí)的注意事項(xiàng)：1、展開室要用溶劑飽和2、注意空氣濕度對(duì)展開劑的影響。3、注意邊緣效應(yīng)4、展開劑的用量5、展開結(jié)束后，立即畫出溶劑前沿24（三）、定位與顯色1、紫外定位法：紫外光常用兩種波254nm與365nm。2、試劑顯色法：噴霧顯色，浸漬顯色25四、柱色譜1、吸附劑和洗脫機(jī)的選擇：TLC的Rf值為0.2-0.3為最佳溶劑2、裝住：干法裝柱，濕法裝柱3、上樣：溶液加樣法，拌樣加樣法4、洗脫：26課堂論述題：簡述展開劑選擇的原理和方法？薄層色譜與液相色譜法比較HPLCTLC每次只能分析一個(gè)樣品在一塊板上點(diǎn)上多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行分離對(duì)樣品制備要求高，必須不含可吸留在柱上的雜質(zhì)，否則柱性能受損用畢一次棄去，可直接用樣品的粗提物點(diǎn)樣可用檢測器種類較少展開后可用多種手段檢測28

小結(jié)測評(píng)1、兩相溶劑萃取法的原理為：Ａ．分配系數(shù)Ｂ．熔點(diǎn)Ｃ．沸點(diǎn)Ｄ．類型2、硅膠作為吸附劑用于吸附色譜時(shí)其為：Ａ．非