DB32T3451-2018栽培稻種中雜草稻混雜檢測(cè)規(guī)程

ICS65.020.20

B22

備案號(hào)：DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3451—2018

栽培稻種中雜草稻檢測(cè)規(guī)程

TestingregulationsofWeedyRiceinCultivatedRice’sSeed

2018-09-06發(fā)布2018-09-30實(shí)施

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB32/T3451—2018

栽培稻種中雜草稻檢測(cè)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了雜草稻的術(shù)語(yǔ)和定義、試劑配制、儀器和用具、照明要求、樣品制備、操作步驟、結(jié)

果計(jì)算等方面的內(nèi)容。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于栽培稻稻種中雜草稻的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB5491糧食、油料檢驗(yàn)扦樣、分樣法

GB/T22505糧油檢驗(yàn)感官檢驗(yàn)環(huán)境照明

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

雜草稻weedyrice

雜草稻(weedyrice)是指在水稻田中可以自我繁衍具有雜草特性的水稻（OryzasativaL.）物種。

3.2

純合體的雜草稻homozygoticweedyrice

栽培稻種子中具有紅果皮的雜草稻。

3.3

雜合體的雜草稻heterozygousweedyrice

雜草稻的花粉飄逸到栽培稻柱頭上發(fā)生雜交，產(chǎn)生的栽培稻種子（2n=24條染色體）中含有雜草

稻的一半染色體（n=12條染色體），但果皮色依然表現(xiàn)為白色。稱為雜草稻雜合體。其種植到田里開

花結(jié)果，就會(huì)產(chǎn)生性狀分離，產(chǎn)生具有紅色果皮的雜草稻種子。

3.4

Rc基因Rcgene

Rc基因是水稻果皮原花色素積累途徑中最重要的調(diào)節(jié)基因之一,位于第７染色體上,全長(zhǎng)約6.4kb,

包含有8個(gè)外顯子,產(chǎn)物為一個(gè)具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)元件的調(diào)節(jié)蛋白。Rc基因具有比rc基因多14

bp插入/缺失，從而設(shè)計(jì)特異性14bp插入/缺失引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)雜合體雜草稻。

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4檢測(cè)前準(zhǔn)備工作

4.1試劑配制

聚丙烯酰胺母液（40%）：按19:1的比例將38g丙烯酰胺和2g甲叉雙丙烯酰胺加入100ml去離

子水中，待溶解后定容，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?xTBE電泳緩沖液1L（母液）：54gTrisbase，

27.5g硼酸，20ml0.5MEDTA（pH8.0），加蒸餾水至1L。10%過(guò)硫酸銨：1g過(guò)硫酸銨溶于10ml蒸

餾水中，4℃冰箱中保存1周左右。400mLNaOH溶液：6g氫氧化鈉，0.076g四硼酸鈉，1.6ml甲

醛(甲醛應(yīng)放入冰箱中，易變性),加蒸餾水至400ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。0.1%AgNO3：取0.1gAgNO3溶解于

100ml蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.2儀器和用具

稻谷檢驗(yàn)出糙機(jī)、電動(dòng)研磨機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳槽、電泳儀、照相機(jī)。

4.3照明要求

操作過(guò)程中照明條件應(yīng)符合GB/T22505的要求。

4.4樣品制備

純合體雜草稻檢測(cè)取樣按GB5491-1985執(zhí)行。上述純合體雜草稻檢測(cè)后，去除紅色糙米，然后將

白色糙米按GB5491-1985中3.1的規(guī)定混勻。將樣品倒在光滑平坦的桌面上或玻璃板上，用兩塊分樣

板將樣品攤成正方形，然后從樣品左右兩邊鏟起樣品約10cm高，對(duì)準(zhǔn)中心同時(shí)倒落，再換一個(gè)方向同

樣操作(中心點(diǎn)不變)，如此反復(fù)混合4次～5次，將樣品攤成等厚的正方形。取50份，每份200粒糙米。

5操作步驟

5.1純合體雜草稻檢測(cè)

使用稻谷檢驗(yàn)出糙機(jī)脫殼，查看糙米的顏色，分別計(jì)數(shù)糙米總數(shù)（m）和紅色糙米數(shù)（m1）。

5.2雜合體雜草稻檢測(cè)

5.2.1磨粉

用電動(dòng)研磨機(jī)將200粒白色糙米碾磨成粉，混合均勻，取4份，各30mg。

5.2.2DNA提取

采用適于提取水稻及其產(chǎn)品DNA的試劑盒方法，進(jìn)行DNA提取。制備DNA模板時(shí)設(shè)置不加任何

試樣的空白對(duì)照。

5.2.3DNA溶液純度測(cè)定和保存

將DNA溶液適當(dāng)稀釋，測(cè)定并記錄其在260nm和280nm的紫外光吸收率，OD260值應(yīng)該在0.05～

1的區(qū)間內(nèi)，OD260nm/OD280nm比值應(yīng)介于1.4～2.0之間，根據(jù)OD260值計(jì)算DNA濃度。依據(jù)

測(cè)得的濃度將DNA溶液稀釋到25ng/uL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2.4PCR反應(yīng)和跑膠

見(jiàn)附錄A。記錄雜合條帶的膠孔數(shù)（n）。

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6結(jié)果統(tǒng)計(jì)

6.1純合體雜草稻檢驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

純合體雜草稻含量（M）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，按式（1）計(jì)算：

M=（m1/m）x100……(1)

式中：

m1-------糙米中紅色糙米的粒數(shù)，單位為粒

m-------糙米的總粒數(shù)，單位為粒。

在重復(fù)性條件下，獲得的四次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果，求其平均值，即為測(cè)試結(jié)果。測(cè)試結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后5

位。

6.2雜合體雜草稻檢驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

雜合體雜草稻含量（N）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，按式（2）計(jì)算：

N=∑（n1/200）x100……(2)

式中：

n1-------雜合條帶的膠孔數(shù)，單位為個(gè)。

在重復(fù)性條件下，獲得的四次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果，求其平均值，即為測(cè)試結(jié)果。測(cè)試結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后5

位。

6.3雜草稻總混雜率檢驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

雜草稻總混雜率（T）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，按式（3）計(jì)算：

T=M+NA……(3)

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BA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

普通PCR方法

A.1引物

引物序列見(jiàn)表A.1，用TE緩沖液（pH8.0）或雙蒸水分別將表A.1引物稀釋到10μmol/L。

表A.1PCR引物序列

PCR產(chǎn)物大小

檢測(cè)基因引物引物序列(5’-----3’)

(bp)

Primer1RED4-For:TTACAGGGGAGCAGAAACA

Rc118

Primer2RED4-Rev:TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC

Primer1RED4-For:TTACAGGGGAGCAGAAACA104

rc

Primer2RED4-Rev:TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC

A.2PCR檢測(cè)

A.2.1PCR反應(yīng)

A.2.1.1試樣PCR反應(yīng)

在PCR反應(yīng)管中按表A.2依次加入反應(yīng)試劑，輕輕混勻，再加約5μL石蠟油。10000rpm離心10s后，

將PCR管插入PCR儀中。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸lmin,30

個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)或在4℃下保存待

用。

表A.2PCR反應(yīng)體系

成分體積(μl)

2×PCRMix4.0

ddH2O4.5

Primerforward(10μmol/L)0.25

Primerreverse(10μmol/L)0.25

模板DNA(10-20ng/μl)1

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注：2×PCRMix成分為dNTP0.2mmolL?1、KCl100mmolL?1、Tris-HCl(pH8.5)20mmolL?1、

TaqPolymerase5U/100μL、MgCl23.0mmolL?1。

A.2.1.2對(duì)照PCR反應(yīng)

在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。陰性對(duì)照是指水稻日本晴品種中

提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；陽(yáng)性對(duì)照，用雜草稻作為PCR反應(yīng)體系的模板；空白對(duì)照，用無(wú)

菌水空白對(duì)照作為PCR反應(yīng)體系的模板。上述各對(duì)照PCR反應(yīng)體系中，除模板外其余組分及PCR反應(yīng)條

件與A.2.1.1相同。

A.2.2PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

A.2.2.16%聚丙烯酰胺凝膠的制作

a)制作底座：在桌面上鋪上報(bào)紙，用于擺放制膠用長(zhǎng)短板，在長(zhǎng)短板左右分別夾上兩片1mm厚薄

塑料片，用于間隔長(zhǎng)短玻璃板，將膠灌入，用大夾子，用于固定玻璃板。按照1：100的比例配制瓊脂糖

凝膠溶液，在微波爐中加熱，沸騰2-3次至溶液澄清后倒入底座槽中，倒至槽子1/3處即可。將已擺放好

的長(zhǎng)短制膠板（中間夾有薄塑料片）插入底座槽，用準(zhǔn)備好的大夾子將其固定在制膠架上。虹吸作用會(huì)

使瓊脂糖進(jìn)入長(zhǎng)短板之間，室溫冷卻后，即可把板子下端封閉。

b)6%聚丙烯酰胺凝膠配制：5×TBE5ml,40%丙烯酰胺3.75ml，去離子水16.25ml，混勻后加入

250ul10%過(guò)硫酸銨和12ulTEMED。攪拌后迅速進(jìn)行灌膠。

c)灌膠：將混合液沿短板的一端慢慢灌入兩板間的縫隙至上端開口處，再將膠孔梳插入兩板之間，

加入少許混合液將縫隙完全灌滿。注意灌膠過(guò)程中不可氣泡，可以通過(guò)震蕩板子將氣泡趕出。

d)聚丙烯酰胺凝膠的凝固：室溫下，聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過(guò)15-20分鐘將完全凝固，在此期間可以根

據(jù)液面的下降不時(shí)用剩余聚丙烯酰胺混合液補(bǔ)足。

e)聚丙烯酰胺凝膠板的安裝：待凝膠徹底凝固后將板子拆下，放入盛有去離子水的盆中，利用水的

推力將膠孔梳取下，并剝離封口用的制膠槽和瓊脂糖，在去離子水中清洗制膠板和加樣孔，然后，將其

安裝在加有1×TBE電泳緩沖液的電泳槽上，準(zhǔn)備加樣、電泳。

A.2.2.2電泳

吸取2μL的PCR產(chǎn)物與1ul加樣緩沖液混合后加入點(diǎn)樣孔中，在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入1ul100bp

Marker，用于判斷產(chǎn)物的長(zhǎng)度。電泳時(shí)電壓設(shè)置為120V，電泳時(shí)間設(shè)置為1小時(shí)。

A.2.2.3AgNO3銀染與顯色：

電泳后，采用銀染方法對(duì)凝膠結(jié)果進(jìn)行顯色，具體步驟：電泳完成后，將膠板取下，用去離子水清

洗之后，輕輕撬開制