人源化抗CD146單克隆抗體的臨床前轉(zhuǎn)化研究

人源化抗CD146單克隆抗體的臨床前轉(zhuǎn)化研究

——抗體中試規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化制備研究背景：鼠源單抗AA98MOLCANCERTHER,2006BBA,2007JCELLPHYSIOL,2008INTJBIOCHEMCELLB2009CLINCANCERRES,2010Oncogene,2011PNAS,2012ScientificReports,2013AA98Blood,2003抗腫瘤血管生成BevacizumabCetuximabNimotuzumabPanitumumabVEGFEGFRAA98CD146抗體藥物從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過程基礎(chǔ)研究抗體人源化改造表達(dá)載體和工程細(xì)胞株構(gòu)建規(guī)模化培養(yǎng)藥理及安全性評(píng)價(jià)臨床應(yīng)用抗體藥物臨床前轉(zhuǎn)化研究下游純化制備人源化huAA98鼠源AA98通過合作研究獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)CHO細(xì)胞株10LWAVE傳統(tǒng)抗體藥物下游制備工藝微濾澄清去除大顆粒雜質(zhì)親和層析捕獲抗體低pH值孵育滅活病毒精細(xì)純化去除痕量雜質(zhì)納米膜過濾清除病毒緩沖體系置換與濃縮分裝及凍干GMP高投入高風(fēng)險(xiǎn)高門檻基礎(chǔ)研究臨床應(yīng)用研究目標(biāo)：實(shí)現(xiàn)非GMP條件下抗體藥物規(guī)?；苽銰MP微濾澄清抗體捕獲精細(xì)純化濃縮換液操作人員儀器設(shè)備試劑原料全封閉無縫連接系統(tǒng)研究方法：首先，以蛋白純度為指標(biāo)，建立純度合格的huAA98純化工藝。然后，基于純度合格的huAA98純化工藝，建立全封閉管路化制備系統(tǒng)。最后，系統(tǒng)放大至中試規(guī)模，實(shí)現(xiàn)非GMP條件下的抗體藥物規(guī)?；苽洹＜兌群细竦膆uAA98抗體純化工藝的建立基于中空纖維柱的抗體藥物前處理工藝的建立濾膜過濾高速離心中空纖維微濾層析介質(zhì)：MabSelectSuRe柱體積：20ml平衡緩沖液：50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2洗脫緩沖液：50mM檸檬酸鹽緩沖液，pH3.0上樣體積：500mlElutionFlowthrough基于ProteinA親和層析的抗體捕獲工藝捕獲后抗體的純度分析huAA98supernatantFlowthroughElutionMarkerheavychainlightchain170kDa130kDa95kDa72kDa55kDa17kDa34kDa26kDa43kDa還原SDSSEC-HPLC單體聚體基于凝膠過濾層析的抗體精純化工藝層析介質(zhì)：Superdex200柱體積：24ml洗脫緩沖液：50mM磷酸鹽緩沖液，pH6.4上樣體積：1ml精細(xì)純化后抗體的純度分析還原SDSSEC-HPLC基于中空纖維柱的抗體藥物后處理工藝的建立超濾濃縮管切向流膜包中空纖維超濾柱全封閉管路化huAA98抗體制備系統(tǒng)的建立全封閉前處理模塊的構(gòu)建全封閉層析模塊的構(gòu)建全封閉后處理模塊的構(gòu)建全封閉管路化制備系統(tǒng)的構(gòu)建經(jīng)全封閉管路化制備后的抗體達(dá)到臨床藥物標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素<0.3EU/ml，ProteinA<100μg/ml，HCP<10μg/ml全封閉管路化系統(tǒng)放大及huAA98抗體中試規(guī)模制備管路化系統(tǒng)的中試規(guī)模放大1L3L5L10L，規(guī)模逐級(jí)放大完成7批次制備共制備獲得10g純品單體huAA98共5.4g達(dá)到熱源及各項(xiàng)殘留符合臨床藥物標(biāo)準(zhǔn)huAA98抗體的中試規(guī)模制備成品抗體的質(zhì)量與活性檢測(cè)還原與非還原SDS純度分析還原SDS非還原SDSSEC-HPLC純度分析批號(hào)濃度(mg/ml)純度內(nèi)毒素ProteinA(ng/ml)宿主蛋白(ng/ml)EU/mlEU/mgAL201111259.82398.9%無無3.3066.590AL2012011310.55599.2%0.1100.0104.02811.365AL2012042622.37797.2%0.1660.00718.11115.462參照藥典標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素<0.3EU/ml，ProteinA<100μg/ml，HCP<10μg/ml連續(xù)三批中試規(guī)模制備的抗體均符合臨床質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成品huAA98在分子水平上保持了良好的抗原結(jié)合活性和特異性成品huAA98與鼠源抗體具有相似的結(jié)合活性成品huAA98保持了對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移與成血管的抑制活性*******************p=0.025A375Tumorweight(g)hIgGhuAA98(50μg/mouse)p=0.016huAA98(100μg/mouse)huAA98(200μg/m