細胞生物學第13章 細胞衰老與凋亡課件

細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡第十三章細胞凋亡與衰老●細胞凋亡(Apoptosis)●細胞衰老(cellularaging或cellsenescence)細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡機體結構細胞增殖細胞分化細胞凋亡細胞信號轉導染色體（DNA與蛋白質的相互作用）衰老細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡一、細胞凋亡的概念及其生物學意義PRIZED

Branna,

Horvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

1.概念細胞凋亡的概念最早是由病理學家Kerr于1972年正式提出的。細胞凋亡是一種具有特征形態(tài)和生化改變的細胞凋亡過程，這些改變是一系列基因活動引起的級聯(lián)反應的結果。又被稱為“細胞程序性死亡”（programmedcelldeath,PCD）細胞凋亡具有利他性。細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡2.研究歷史（階段劃分）（1）細胞凋亡的形態(tài)學研究：1972年前，建立和形成細胞凋亡的概念（2）細胞凋亡的生物化學研究：DNA的特征性降解、蛋白質與RNA的合成、Ca2+濃度的變化、細胞凋亡的酶學研究（3）細胞凋亡的分子生物學研究：80年代后期，主要研究細胞凋亡過程中相關的基因以及細胞凋亡信號轉導系統(tǒng)等細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡（1）

胚胎發(fā)育（2）

清除抗原激活的淋巴細胞（3）

清除癌變的細胞（4）

清除病毒感染的細胞（5）

防止炎癥的產生（6）

細胞新陳更新的需要3.細胞調亡的生物學意義細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

蝌蚪尾的消失細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

脊椎動物神經系統(tǒng)的發(fā)育細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡發(fā)育過程中手和足的成形過程細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡（1）

AIDS：HIV誘導淋巴細胞凋亡（2）自身免疫疾病：激活的淋巴細胞凋亡缺陷（3）癌癥：凋亡缺陷（4）老年癡呆/中風：過多神經細胞凋亡

4、細胞凋亡與疾病細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡二、細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學特征壞死細胞(necrosis)凋亡細胞(apoptosis)細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡1.細胞凋亡與細胞壞死特征Apoptosisnecrosis誘導因素生理及弱刺激強烈刺激細胞數(shù)量單個細胞丟失成群細胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失染色質凝聚成半月狀稀疏成網狀細胞核早期固縮斷裂晚期破碎細胞器無明顯變化腫脹、破損細胞內溶物無釋放釋放細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機降解能量需求依賴ATP不依賴ATP大分子合成一般需要不需要后果不引起炎癥引起炎癥意義生理死亡方式病理死亡方式細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡2.細胞凋亡的形態(tài)學特征細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

左，正常胸腺細胞；右，凋亡胸腺細胞（注意凋亡小體）細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡3.細胞凋亡的生化特征細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖1．細胞色素c誘導0h2．細胞色素c誘導1h3．細胞色素c誘導2h4．細胞色素c誘導3h5．細胞色素c誘導4h6．陰性對照7．Marker

（自趙允、翟中和）細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡4.誘導細胞凋亡的因子◆物理性因子包括射線（紫外線，

射線等）較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，DNA和蛋白質合成的抑制劑、激素、細胞生長因子、腫瘤壞死因子

（TNF

）、抗Fas/Apo-1/CD95抗體等細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡5.細胞凋亡的檢測形態(tài)學技術瓊脂糖電泳技術DNA片段原位標記法ELISACaspase-3活性的檢測磷脂酰絲氨酸外翻分析細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡形態(tài)學技術1光學顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。

貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割

成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。DNA片段原位標記法細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡ELISA細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡Caspase-3活性的檢測細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡磷脂酰絲氨酸外翻分析細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡三、細胞凋亡的分子調控機理●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1。一只四齡(L4)的線蟲(A.C.elegans)幼蟲?？梢钥匆娂t色的細胞核、藍色的DNA與綠色的上皮細胞邊緣。本照片由麻省理工Horvitz實驗室提供細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡1.

Caspase家族與凋亡◆Caspase家族

Caspase活性位點是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡◆caspase超家族成員及其相應底物細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

◆

Caspase活化Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點裂解活化或自身活化。Caspase8Pro-Caspase3ActiveCaspase3Pro-Caspase7ActiveCaspase7A．通過激活的Caspase-Caspase級聯(lián)反應細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

B．

通過誘導的“近域效應”（Proximity）

凋亡受體介導的細胞凋亡

DDFADDPro-Caspase8FasFasFas-LActiveCaspase8Apoptosis細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

D、

通過與調節(jié)亞單位結合線粒體依賴的細胞凋亡

C、通過去除抑制因子：IAPCaspaseSmacIAPCaspaseSmacActive+CaspaseCascadeApoptosisDeathSignalsBADmitochondriaCytochromecApaf1Pro-Caspase9ActiveCaspase9細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡◆胞外信號分子誘導的細胞凋亡途徑

當細胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細胞表面信號分子受體相互聚集并與細胞內的銜接蛋白(Adaptorprotein)結合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部Procaspase相互活化并產生級聯(lián)反應，使細胞凋亡。下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纖層蛋白，導致細胞核形成凋亡小體；裂解DNase結合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、脫落，便于細胞吞噬；導致膜脂PS重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡2.Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細胞凋亡；與線粒體及內質網膜相結合；

Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結構域；

Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3。細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡BCL-2家族成員細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡Bcl-2、線粒體與細胞凋亡◆當Caspase8活化后，它一方面作用Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個片段，其中含BH3結構域的C-端片段被運送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結構域形成復合物，導致細胞色素C釋放。CytC與胞質中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細胞凋亡.細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡線粒體途徑及其信號傳遞（1）γ射線或神經酰胺等

→破壞線粒體內電子傳遞和能量代謝

→細胞凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡

→細胞凋亡（2）釋放Cas活化因子UX、Bax表達↑→細胞色素C釋放cytochromeC與凋亡促進因子結合→Apaf-1分子構象改變

→結合pro-Cas-9→Cas-9活化→水解pro-Cas-3→Cas-3活化→細胞凋亡→呼吸鏈中斷、ATP↓、氧自由基↑細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡釋放DPF（deathpromotingfactor）

→激活pro-Cas-9

→激活Cas-3

*直接釋放pro-Cas-3

→參與細胞凋亡信號傳導釋放氧自由基

*呼吸鏈將電子向分子氧傳遞

→產生氧自由基

→細胞不可逆損傷→凋亡（3）線粒體膜滲透性改變

→線粒體內高滲狀態(tài)

→細胞骨架蛋白受壓→凋亡細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡MitochondrionApoptoticStimuli(UVandg-irradiation;chemodrugs)Procaspase-9IAPProcaspase-3Caspase-3Caspase-8Procaspase-8Deathligand(Fas;Trail)DeathreceptortBidSmac/DiabloApoptosisCaspase-9細胞凋亡的分子機理細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡Anoverviewofthedeath-receptorpathwayandthemitochodrialpathway細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡二、細胞衰老(cellularaging或cellsenescence)什么是衰老？衰老又稱老化，通常指生物發(fā)育成熟后，在正常情況下隨著年齡的增加，機能減退，內環(huán)境穩(wěn)定性下降，結構中心組分退行性，趨向死亡的不可逆現(xiàn)象。衰老發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個體水平、細胞水平及分子水平等不同層次。細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡●Hayflick界限(HayflickLimitation）●細胞在體內條件下的衰老●衰老細胞結構的變化●細胞衰老的分子機理細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡1.

Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：細胞，至少是培養(yǎng)的細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限.◆癌細胞或培養(yǎng)的細胞系是不正常細胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經不同于原先的細胞.◆細胞的增殖能力與供體年齡有關.◆物種壽命與培養(yǎng)細胞壽命之間存在著一定的關系.細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡細胞來源人胚肺成纖維細胞中年人成纖維細胞老年人成纖維細胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數(shù)細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡2.細胞在體內條件下的衰老●在機體內，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生●正常情況下終生保持分裂的細胞，其分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？

◆衰老動物體內，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長

◆衰老個體內的環(huán)境因素影響了細胞的增殖和衰老◆骨髓干細胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細胞增殖速度也趨緩慢細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡3.衰老細胞結構的變化●細胞核的變化:體積增大，核膜內折、染色質固縮化●內質網的變化:衰老動物內質網成分彌散性地分散于核周胞質中，粗面內質網的總量似乎是減少了●線粒體的變化 ◆通常，細胞中線粒體的數(shù)量隨年齡減少，而其體積則隨年齡增大細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡3.衰老細胞結構的變化●致密體的生成●膜系統(tǒng)的變化

◆衰老的細胞，其膜流動性降低、韌性減小

◆衰老細胞間間隙連接及膜內顆粒的分布也發(fā)生變化細胞生物學第13章細胞衰老與凋亡4.細胞衰老的分子機理●氧化性損傷學說－－－差錯學