（高清版）DB37∕T 3086-2017 豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)技術(shù)　　

ICS65.020.30DB37DB37/T3086—20172017-12-29發(fā)布2018-01-29實(shí)施IDB37/T3086—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳蕾、杜以軍、齊靜、叢曉燕、孫文博、陳智、郭立輝、于江、吳家強(qiáng)、李俊、時(shí)建立。1DB37/T3086—2017豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)技術(shù)的操作要求本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬附紅細(xì)胞體的實(shí)驗(yàn)室診斷、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等。2實(shí)驗(yàn)室生物安全要求實(shí)驗(yàn)室必須為生物安全Ⅱ級(jí)(BSL-2級(jí))及以上實(shí)驗(yàn)室。3規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法4術(shù)語與定義下列術(shù)語與定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。十二烷基硫酸鈉。5儀器設(shè)備和試劑5.1儀器設(shè)備5.1.1微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭。5.1.220000r/min低溫高速離心機(jī)。5.1.3電熱恒溫水槽。5.1.4穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀。5.1.5水平電泳槽。5.1.6凝膠成像系統(tǒng)。5.1.7紫外透射反射分析儀。5.1.8電磁爐。5.1.9燒杯(1000mL)。2DB37/T3086—20175.1.10電子天平精度為：0.001g。5.1.132℃~8℃冰箱。5.2試劑除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。5.2.1蛋白酶K(見附錄A.1)。5.2.210%SDS液(見附錄A.2)。5.2.370%乙醇(見附錄A.3)。5.2.41.0%瓊脂糖凝膠(見附錄A.4)。5.2.6超純水：符合GB/T6682,三級(jí)。MS-Fwd:5-CGAGCGCAACCCTTCATAT-3;MS-Rev:5-CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3;擴(kuò)增片段大小127bp。6操作程序6.1樣品的采集和處理臨床上豬的血液(肝素抗凝血),置于2℃~8℃冰箱保存。6.1.2.1取肝素抗凝血液約5ml。6.2.1取肝素抗凝血500μL于1.5mL離心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的6.2.5取上清于一新離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃靜置20min,10000g離心15min,6.2.6加入70%的乙醇沖洗沉淀表面及管壁，棄乙醇，晾干。6.2.7加入100μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)中同時(shí)設(shè)立豬附紅細(xì)胞體DNA作為陽性對(duì)照和滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。3DB37/T3086—2017序號(hào)體系組成體系含量1滅菌雙蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶首先加入雙蒸滅菌水，然后按順序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混懸，瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。循環(huán)參數(shù)為95℃5min,94℃30s,52℃45s,72℃1min,6.4.1制備1.0%瓊脂糖凝膠板，見附錄A.4。6.4.3加入分子量標(biāo)準(zhǔn)。6.4.5用凝膠成像儀觀察、掃描圖片存檔。6.4.6用分子量標(biāo)準(zhǔn)比較判斷PCR片段大小。7.1在陽性對(duì)照出現(xiàn)127bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無此擴(kuò)增帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立(參見附錄A.5)。7.2被檢樣品出現(xiàn)127bp擴(kuò)增帶判定為豬附紅細(xì)胞體陽性，未出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶的樣品判定為豬附紅細(xì)胞體陰性(參見附錄A.6)。4DB37/T3086—2017(規(guī)范性附錄)試劑的配制A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)