TFDSA-中成藥中大米源性成分檢測(cè)-PCR法編制說(shuō)明

《中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)方法PCR法》（征求意見(jiàn)稿）編制說(shuō)明一、編制背景中藥質(zhì)量控制一直是中藥研究與生產(chǎn)的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，也是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的重要基礎(chǔ)和關(guān)鍵。在藥品抽檢的不合格產(chǎn)品中，中成藥和中藥飲片占比較高，以次充好、染色增重、摻雜使假、違法加工等問(wèn)題層出不窮。為牟取暴利，部分不法商販常以低成本的米粉（湯）、淀粉、糊精或植物蛋白摻入中成藥中冒充高價(jià)中藥材。因此建立準(zhǔn)確鑒別大米源性成分摻偽的技術(shù)，對(duì)維護(hù)和監(jiān)督中成藥用藥安全具有重要意義。目前對(duì)于大米成分的檢查主要集中在食品領(lǐng)域，在中成藥中相關(guān)的檢查方法有限。針對(duì)中成藥摻偽水稻源性成分的檢測(cè)方法，在《中國(guó)藥典》及相關(guān)藥品標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)涉及。檢測(cè)中成藥中的米粉（湯）、淀粉、糊精等摻假成分常采用感觀(guān)檢測(cè)和化學(xué)分析方法，但是該類(lèi)方法具有人為判斷誤差大、靈敏度低、特異性差等缺點(diǎn)已經(jīng)滿(mǎn)足不了市場(chǎng)監(jiān)督的需要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)在水稻源性成分的鑒別中得到不斷應(yīng)用，很大程度彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒別方法的不足。中成藥中摻偽成分很多為淀粉，但由于缺乏特征性成分，顯微及化學(xué)方法很難鑒別。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)在大米源性成分的鑒別中得到不斷應(yīng)用，很大程度彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒別方法的不足。2020年版《中國(guó)藥典》增加了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法通則，進(jìn)一步促進(jìn)了中藥分子鑒定技術(shù)的深入和普及，然而對(duì)于中成藥的分子鑒定研究報(bào)道相對(duì)較少，獲取高質(zhì)足量的DNA較為困難是其難以采用分子鑒定技術(shù)的重要原因。有針對(duì)特殊樣品的水稻源成分的檢測(cè)方法報(bào)道，但缺少針對(duì)中成藥基質(zhì)大米源性成分的檢測(cè)方法。中成藥成分復(fù)雜，因此本研究以摻偽成分為研究對(duì)象，基于特異性擴(kuò)增的方法，篩選具有高度特異性的大米源性成分鑒定引物，僅能擴(kuò)增出大米源性成分DNA模板中的特定序列，從而建立中成藥中大米源性成分摻偽問(wèn)題的鑒定方法，為打擊假冒偽劣產(chǎn)品提供新的技術(shù)手段。目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)專(zhuān)門(mén)針對(duì)中成藥中大米源性成分檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，僅在國(guó)家藥監(jiān)局發(fā)布的4個(gè)中成藥補(bǔ)充檢驗(yàn)公告中有涉及，黃連上清丸（水丸）、龍膽瀉肝丸（水丸）、防風(fēng)通圣丸（水丸）和風(fēng)寒咳嗽丸（水丸）中水稻源性成分檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法（BJY202107）。該方法僅包含四味中成藥，無(wú)法滿(mǎn)足企業(yè)對(duì)原料和成品進(jìn)行質(zhì)量控制，以及相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)、審評(píng)和監(jiān)管部門(mén)對(duì)相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行日常檢測(cè)和監(jiān)管工作的需要。為了幫助中成藥收購(gòu)、倉(cāng)儲(chǔ)、生產(chǎn)、流通、質(zhì)量控制、市場(chǎng)監(jiān)督等領(lǐng)域，能夠通過(guò)快速檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大米源性成分，保障中成藥的質(zhì)量安全，保護(hù)人體健康。南京江北新區(qū)生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺(tái)收集相關(guān)資料，進(jìn)行實(shí)際調(diào)研，借鑒《中國(guó)藥典》等國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)的要求，聯(lián)合江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院等各相關(guān)單位研究制定該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)中成藥中的大米源性成分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，能夠精準(zhǔn)判定中成藥產(chǎn)品是否與標(biāo)簽標(biāo)注成分的一致性。可為監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)支撐，同時(shí)對(duì)保障消費(fèi)者的健康和權(quán)益，規(guī)范中成藥市場(chǎng)等具有十分重要的意義。二、任務(wù)來(lái)源根據(jù)中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)2025年1月發(fā)布的關(guān)于《中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)方法PCR法》等兩項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)的公告，由南京江北新區(qū)生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺(tái)有限公司作為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)方法PCR法》的牽頭起草單位，負(fù)責(zé)組織該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的編制工作。三、標(biāo)準(zhǔn)的編制（一）標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位、起草人及其所做的工作1.項(xiàng)目負(fù)責(zé)人龔玉霞：主要負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)總體策劃和協(xié)調(diào)；呂興祥：負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容統(tǒng)籌；徐文君、李桂杰負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的查新、資料和實(shí)際調(diào)研，標(biāo)準(zhǔn)文本的起草和修改及標(biāo)準(zhǔn)的送審及報(bào)批；楊兵、孟鵬、盧清瑤、徐曉嵐、楊曉莉、楊廣滿(mǎn)、劉立芳等負(fù)責(zé)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本提出補(bǔ)充和修改意見(jiàn)。2.項(xiàng)目主要起草人：本標(biāo)準(zhǔn)由龔玉霞、呂興祥、徐文君、李桂杰、盧清瑤、徐曉嵐、楊兵、孟鵬、楊曉莉、楊廣滿(mǎn)、劉立芳等專(zhuān)家共同起草。3.標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位本標(biāo)準(zhǔn)由南京江北新區(qū)生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺(tái)有限公司、江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、斯坦德生物醫(yī)藥（江蘇）有限公司與檢測(cè)技術(shù)研究所、安徽華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司等單位共同起草。4.標(biāo)準(zhǔn)起草組成員主要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)涉及的相關(guān)技術(shù)問(wèn)題，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研、問(wèn)卷咨詢(xún)、網(wǎng)絡(luò)檢索等工作，對(duì)國(guó)外和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)區(qū)情況進(jìn)行了深入的研究。同時(shí)召開(kāi)研討會(huì)議對(duì)關(guān)鍵性的問(wèn)題征集行業(yè)內(nèi)專(zhuān)家的意見(jiàn)和建議。（二）標(biāo)準(zhǔn)編制的原則和主要工作過(guò)程1.編制原則（1）科學(xué)性原則本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定進(jìn)行編寫(xiě)和表述，力求做到“統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性、規(guī)范性”。（2）先進(jìn)性原則本文件為新制定標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容符合檢驗(yàn)檢測(cè)行業(yè)現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)要求，符合國(guó)內(nèi)企事業(yè)單位和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的實(shí)際情況，兼顧方法的適用性和可操作性。既能適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)和檢測(cè)需要，又能保證方法的推廣應(yīng)用。填補(bǔ)了中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)的行業(yè)空白。（3）適用性原則確定了標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍，本標(biāo)準(zhǔn)適用于中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)。2.主要工作過(guò)程為了確保標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的準(zhǔn)確性、實(shí)用性，保證標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容科學(xué)、合理、協(xié)調(diào)、可行，南京江北新區(qū)生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺(tái)有限公司、江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院組成制定小組，針對(duì)中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)制修訂情況進(jìn)行了調(diào)研。2024年9-11月，進(jìn)行資料和實(shí)際調(diào)研，選定標(biāo)準(zhǔn)方向和基本內(nèi)容框架，并編制標(biāo)準(zhǔn)草稿；2024年12月，提出立項(xiàng)申請(qǐng)。2025年1月，本標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目通過(guò)立項(xiàng)；2025年1月，編制組形成對(duì)外征求意見(jiàn)稿；2025年1-2月，擬對(duì)外公開(kāi)征求意見(jiàn)，通過(guò)中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)網(wǎng)站及公眾號(hào)、一對(duì)一郵件等多種方式進(jìn)行。（三）標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容及論據(jù)本文件根據(jù)新版GB/T1.1的要求編制，對(duì)多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)文件、研究成果進(jìn)行梳理，并依據(jù)中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)情況，確定了本方法。標(biāo)準(zhǔn)制定的主要內(nèi)容及其依據(jù)簡(jiǎn)要介紹如下：1.范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于中成藥中大米源性成分定性檢測(cè)。2.規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3.術(shù)語(yǔ)和定義除GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則》所界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件之外，特別增加下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件：（1）PCR法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，指在PCR體系中加入擴(kuò)增預(yù)混液，利用核酸電泳技術(shù)檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。（2）核酸電泳技術(shù)利用核酸電泳技術(shù)鑒定PCR結(jié)果。（3）基因克隆與測(cè)序技術(shù)利用基因測(cè)序儀確定DNA序列。4.標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容（1）原理利用裂解液提取中成藥中大米源性DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR陽(yáng)性產(chǎn)物采用克隆測(cè)序進(jìn)行確證。（2）樣品制備的要求選取出具有代表性的樣品適量，用高速粉碎機(jī)粉碎至全部過(guò)篩網(wǎng)，使其粒徑小于2mm，充分混合均勻，儲(chǔ)存于潔凈的樣品袋中密封保存，供檢測(cè)用。（3）樣品中DNA提取稱(chēng)取粉碎后的樣品（粒度為100目稱(chēng)取50mg，60目稱(chēng)取100mg，20目稱(chēng)取200mg），于1.5mL離心管中，加入600μL~800μLCTAB提取緩沖液，65℃30min，期間不時(shí)振蕩，混勻；12000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清液400μL至潔凈離心管中，加入400μL氯仿/異戊醇（24：1）抽提液，混勻，12000g離心5min，取上清液；加0.8倍體積異丙醇，沉淀，12000g離心5min，棄上清液，70%乙醇洗滌一次，晾干；加入50μLTE緩沖溶液，溶解沉淀。（4）引物特異性試驗(yàn)分別以大米粉、大麥、小米、蕎麥、高粱樣品總DNA為擴(kuò)增模板，使用大米特異性引物對(duì)上述各種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，大米粉在50~100bp間出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明引物特異性良好。（5）靈敏性實(shí)驗(yàn)將大米和小麥烘干后研磨成粉，將大米粉和小麥粉按質(zhì)量混勻，制備出大米粉成分占0.05%、0.1%、0.5%、1%的樣品，將上述樣品充分混勻，提取DNA為擴(kuò)增模板，使用大米種屬特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。開(kāi)展靈敏性試驗(yàn)獲得本研究建立的大米種屬特異性PCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限。結(jié)果顯示大米不同成分的含量為0.1%的樣品對(duì)應(yīng)的泳道仍有明顯條帶，說(shuō)明大米源性成分檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1%。四、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容與現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)