中性蛋白酶（NP）活性檢測試劑盒實驗解決方案

中性蛋白酶（NP）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理中性蛋白酶（NP）在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無毒、水解能力強、作用范圍廣等特點，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。CheKine?中性蛋白酶（NP）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動物組織、血清或血漿等生物樣本。在該試劑盒中，中性條件下，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；鎢藍在680nm有特征吸收峰，通過測定其吸光度增加，來計算NP活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見光分光光度計（能測680nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機、恒溫箱·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：臨用前配制；48T加入2.4mL去離子水，96T加入4.8mL去離子水，充分溶解，用不完的試劑4℃避光可保存3天。ReagentIII：臨用前配制；48T加入5mLReagentI，96T加入10mLReagentI，沸水浴中磁力攪拌溶解（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱15-30min，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用），用不完的試劑4℃避光可保存3天。ReagentIV：臨用前配制；48T加入12mL去離子水，96T加入24mL去離子水，充分溶解，用不完的試劑4℃可保存3天。ReagentV：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ReagentII有刺激性氣味，ReagentV有毒，建議在通風(fēng)櫥進行實驗。Standard：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLReagentI，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到680nm，可見光分光光度計用去離子水調(diào)零。ReagentII、III、IV于30℃放置30min。操作表（下述操作在1.5mL離心管中操作）：試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測定孔（μL）對照孔（μL）樣本002020ReagentII040ReagentIII400混勻后置于30℃孵育10minReagentII400ReagentIII040混勻后8,000g，4℃離心10min，取上清上清液004040Standard04000去離子水40000ReagentIV200200200200ReagentV40404040混勻后置于30℃孵育20min取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中，記錄680nm處吸光值，空白孔記為A空白，標(biāo)準(zhǔn)孔記為A標(biāo)準(zhǔn)，測定孔記為A測定，對照孔記為A對照。計算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：(1)空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次。實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。(2)如果反應(yīng)較弱，ΔA測定小于0.002可適當(dāng)加大樣本量，或延長反應(yīng)時間（20-30min），即第一步水浴時間，最后計算酶活時對公式進行修改。如果ΔA測定大于0.5，樣本可用去離子水進一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。NP活性的計算：按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。NP(U/mgprot)=C標(biāo)準(zhǔn)品×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(Cpr×V反)÷T=125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。NP(U/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)品×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(W×V反÷V提)÷T=125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W按樣本體積計算：酶活單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。NP(U/mL)=C標(biāo)準(zhǔn)品×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷V反÷T=125×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，0.04mL；V提：提取液總體積，1mL；T：催化反應(yīng)時間，10min；W：樣品質(zhì)量，g。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定水稻莖葉和小鼠肝臟中NP的活性相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1030CheKine?超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（微量法）KTB1040CheKine?過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒（微量法）K