12基因工程的基本操作程序(二)

復(fù)習(xí)回顧1、基因工程又稱(chēng)為？2、基因工程中用到的工具中，“分子手術(shù)刀”是？來(lái)源是？其作用是？體現(xiàn)了酶的什么特性？作用部位是什么鍵？3、限制酶切割之后的結(jié)果是產(chǎn)生？從中軸線兩側(cè)切割得到的是什么末端？從中軸線處切開(kāi)呢？4、獲得目的基因需要切幾個(gè)切口？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？5、“分子縫合針”是？根據(jù)什么分為兩大類(lèi)？哪兩大類(lèi)？這兩類(lèi)酶的區(qū)別是？6、載體主要有哪幾類(lèi)？最常用的是？它的本質(zhì)是？載體必須具備的四個(gè)條件是？大腸桿菌(EcoRI)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。寫(xiě)出切開(kāi)后產(chǎn)生的粘性末端?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛟思?xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達(dá),上

游有啟動(dòng)子，下游有終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。一、目的基因的獲取目的基因供體生物細(xì)胞取出DNA限制酶剪去多余部分限制酶1.目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫(kù)中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成1.概念：基因文庫(kù)（genelibrary）基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)）

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱(chēng)為基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù).部分基因文庫(kù):

基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系3.如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。4.為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？

構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。

但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR——多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過(guò)此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。PCR技術(shù)原理：前提：原料能量方式PCR擴(kuò)增儀DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式擴(kuò)增，

即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；

過(guò)程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃引物與部分模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸3.人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。目的：組成：1、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代，2、使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)復(fù)習(xí)回顧1、基因工程的基本操作程序的四個(gè)步驟是？核心是？2、目的基因指的是什么基因？3、獲取目的基因常用的三種方法是？其中人工合成法又包括哪兩種?4、基因文庫(kù)包括哪兩類(lèi)？它們有什么區(qū)別？5、PCR的原理是？PCR擴(kuò)增過(guò)程中的解旋方式是？PCR需要的條件有？7、基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的是？8、一個(gè)基因表達(dá)載體的組成包括哪幾部分？9、標(biāo)記基因的作用是？10、啟動(dòng)子，終止子的位置，作用？起始密碼子，終止密碼子呢？三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（雙、裸）基因槍法（單）花粉管通道法——顯微注射技術(shù)——用鈣離子處理細(xì)胞得到感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。③過(guò)程：（2）基因槍法（3）花粉管通道法2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（雙、裸）基因槍法（單）花粉管通道法——顯微注射技術(shù)——用鈣離子處理細(xì)胞得到感受態(tài)細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功（一）、檢測(cè)1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因

(關(guān)鍵步驟)①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明基因已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:知識(shí)延伸——DNA分子雜交技術(shù)

該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開(kāi)，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。歸納步驟（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原-抗體雜交②過(guò)程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA歸納步驟(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原-抗體雜交歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)2基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥(niǎo)槍法)某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶9、春去春又回，新桃換舊符。在那桃花盛開(kāi)的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽(yáng)光，心情像桃花一樣美麗，日子像桃子一樣甜蜜。2月-252月-25Tuesday,February18,202510、人的志向通常和他們的能力成正比例。12:54:5112:54:5112:542/18/202512:54:51PM11、夫?qū)W須志也，才須學(xué)也，非學(xué)無(wú)以廣才，非志無(wú)以成學(xué)。2月-2512:54:5112:54Feb-2518-Feb-2512、越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。12:54:5112:54:5112:54Tuesday,February18,202513、志不立，天下無(wú)可成之事。2月-252月-2512:54:5112:54:51February18,202514、ThankyouverymuchfortakingmewithyouonthatsplendidoutingtoLondon.ItwasthefirsttimethatIhadseentheToweroranyoftheotherfamoussights.IfI'dgonealone,Icouldn'thaveseennearlyasmuch,becauseIwouldn'thaveknownmywayabout.。18二月2025