KTB3120-CN-蔗糖磷酸化酶（SP）活性檢測試劑盒（微量法）

蔗糖磷酸化酶（SP）活性檢測試劑盒（微量法）原理蔗糖磷酸化酶（SucrosePhosphorylase，SP，EC）主要存在于微生物和植物中，屬于糖基水解酶13家族，是一種催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖。該酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖為供體，多類物質(zhì)如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷。CheKine?蔗糖磷酸化酶（SP）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測植物組織、真菌樣本。在該試劑盒中，SP能夠催化蔗糖產(chǎn)生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH，導(dǎo)致340nm光吸收值增加。通過340nm吸光度的增加速率來反映SP活性。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃AssayBuffer5mL10mL4℃ReagentⅠPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentII0.25mL0.5mL4℃，避光保存ReagentIII0.25mL0.5mL4℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentVIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個預(yù)期差異較大的樣本進行預(yù)實驗。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReagentI：臨用前配制；48T加入3.5mL去離子水，96T加入7mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑4℃避光保存2周。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentIV：臨用前配制；48T加入0.7mL去離子水，96T加入1.4mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentV：臨用前配制；48T加入0.7mL去離子水，96T加入1.4mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個月，避免反復(fù)凍融。ReagentVI：臨用前配制；48T加入1.4mL去離子水，96T加入2.8mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。ReagentVII：臨用前配制；48T加入1.4mL去離子水，96T加入2.8mL去離子水，充分溶解。用不完的試劑-20℃避光分裝保存2周，避免反復(fù)凍融。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。真菌：收集500萬真菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗真菌，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎真菌30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標(biāo)儀或紫外光分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，紫外光分光光度計用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）對照孔（μL）AssayBuffer6585ReagentⅠ5050ReagentII33ReagentIII22ReagentIV1010ReagentV1010ReagentVI2020ReagentVII2020混勻，37℃保溫5min樣本200充分混勻，記錄340nm處10s時吸光值A(chǔ)1，37℃反應(yīng)10min記錄130s時的吸光值A(chǔ)2。測定孔記為A測定，對照孔記為A對照。計算ΔA=(A2測定-A1測定)-(A2對照-A1對照)。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果ΔA小于0.05可適當(dāng)加大樣本量。如果A大于1或ΔA大于0.6，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。若ΔA出現(xiàn)負值，則說明樣本中不含SP或已降解。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。SP活性的計算使用96孔UV板測定的計算公式如下按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：37℃，pH6.8時，每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。SP(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=1,608×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計算：酶活單位定義：37℃，pH6.8時，每克樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。SP(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1,608×ΔA÷W按真菌數(shù)量計算酶活單位定義：37℃，pH6.8時，每104真菌每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。SP(U/104)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=1,608×ΔA÷nV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；n：真菌數(shù)量，以萬計。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d：0.5cm調(diào)整為d：1cm進行計算即可。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗對樣品進行檢測。Figure1.本試劑盒測定玉米種子和芒果果實中SP的活性。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB3110CheKi