KTB4017-CN-亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）原理亞硝酸還原酶（NiR）是亞硝態(tài)氮還原過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在自然界氮素循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累，降低其對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育的毒害作用。CheKine?亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）能夠檢測(cè)植物組織、細(xì)菌、真菌樣本中亞硝酸還原酶活性，其原理是亞硝酸還原酶可將NO2-還原為NO，使樣本中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2-減少，即540nm處吸光值的變化可反映樣本中NiR的活性。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲(chǔ)存條件48T96TExtractionBuffer60mL120mL4℃ReagentⅠ2.8mL5.6mL4℃ReagentⅡPowder×1vialPowder×1vial4℃ReagentIII2.5mL5mL4℃ReagentIV5mL10mL4℃，避光保存ReagentV5mL10mL4℃，避光保存Standard1mL1mL4℃注意：正式檢測(cè)前，建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測(cè)540nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機(jī)、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：臨用前配制；48T加入2.5mL去離子水，96T加入5mL去離子水，充分溶解待用。4℃可保存2周。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）。4℃保存。ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室溫（如出現(xiàn)沉淀可以70-80℃加熱溶解）。4℃避光保存。ReagentV：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ReagentI有毒，ReagentIV和ReagentV有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。WorkingReagent：臨用前根據(jù)用量將ReagentIV和ReagentV以1：1的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。Standard：10μmol/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品制備：10μmol/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照下表所示，進(jìn)一步稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品：序號(hào)Standard體積去離子水體積（μL）濃度（μmol/mL）Std.120μL10μmol/mLStandard9800.2Std.2500μLofStd.1(0.2μmol/mL)5000.1Std.3500μLofStd.2(0.1μmol/mL)5000.05Std.4500μLofStd.3(0.05μmol/mL)5000.025Std.5500μLofStd.4(0.025μmol/mL)5000.0125Std.6500μLofStd.5(0.0125μmol/mL)5000.00625Std.7500μLofStd.6(0.00625μmol/mL)5000.003125Std.805000（空白管）注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。測(cè)定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g的新鮮組織，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴超聲波提取（300W，超聲5s，間隔8s，總時(shí)間5min），10,000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測(cè)。細(xì)菌或真菌細(xì)胞：收集500萬(wàn)細(xì)菌或真菌細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)菌或真菌細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)菌或真菌細(xì)胞3min（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測(cè)。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540nm。可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在1.5mLEP管中進(jìn)行）：試劑基質(zhì)管（μL）對(duì)照管（μL）測(cè)定管（μL）標(biāo)準(zhǔn)管（μL）樣本020200去離子水204000ReagentⅠ400400ReagentⅡ4040400混勻后，25℃孵育1hReagentIII4040400充分震蕩30s，常溫靜置5min，取上清至微量玻璃比色皿或96孔板中上清液7070700Standard00070WorkingReagent140140140140充分混勻，常溫靜置5min，測(cè)定540nm各管吸光值，分別記為A基質(zhì)、A對(duì)照、A測(cè)定、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A基質(zhì)-(A測(cè)定-A對(duì)照)，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白管和基質(zhì)管只需測(cè)1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測(cè)定小于0.01可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測(cè)定大于0.7，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA測(cè)定帶入方程得到x(μmol/mL)。2.NIR活性的計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每mg組織蛋白每小時(shí)還原1μmolNO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(U/mgprot)=x×V反總÷V樣×V樣總÷(Cpr×V樣總)÷T=x×7÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每g組織每小時(shí)還原1μmolNO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(U/g質(zhì)量)=x×V反總÷V樣×V樣總÷W÷T=x×7÷W按細(xì)菌或真菌細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：?jiǎn)挝欢x：每104個(gè)細(xì)菌或真菌細(xì)胞每小時(shí)還原1μmolNO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(U/104)=x×V反總÷V樣×V樣總÷N÷T=x×7÷NV反總：取上清液前的反應(yīng)體系體積，0.14mL；V樣：加入的樣本體積，0.02mL；V樣總：加入的ExtractionBuffer體積，1.0mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或真菌細(xì)胞數(shù)量，104。結(jié)果展示Figure1.本試劑盒測(cè)定擬南芥和平菇中NiR的活性Figure2.StandardCurveofNi