埃博拉出血熱檢疫技術(shù)規(guī)范

埃博拉出血熱檢疫技術(shù)規(guī)范26儀器和設(shè)備6.1PCR擴(kuò)增儀。6.2熒光定量PCR儀。6.3水平電泳儀。6.4凝膠成像儀。6.5普通冰箱和-80℃冰箱。6.6低溫冷凍離心機(jī)(可控溫至4℃,離心速度可達(dá)12000g以上)。6.7二級生物安全柜。6.8高壓滅菌鍋。6.9微量可調(diào)移液器(2μL,10L,100L,1000L)及配套帶濾芯吸頭。7試劑和材料在檢測中使用的試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的一級水的要求。7.4三氯甲烷。7.5異丙醇：使用前-20℃預(yù)冷。7.7溴化乙錠(EB):10mg/mL,使用濃度為05temL.7.8TagDNA酵：-20℃保存。7.9dNTPs:含dCTP、dGTP、dATPdITTP各10mmolL的混合物，-20℃保存。7.10AMV逆轉(zhuǎn)錄酶：-20℃保存。7.11瓊脂糖。7.12DNAMarker(100.-20006p)7.14上樣緩沖液。7.152x熒光PCR預(yù)混液。8檢驗(yàn)程序8.1樣品采集、保存及運(yùn)輸樣品的采集按照GB/T18088執(zhí)行。樣品溫度應(yīng)保持在0℃以下。樣品的保存和運(yùn)輸?shù)纳锇踩髤⒄铡恫≡⑸飳?shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》的有關(guān)要求執(zhí)行8.2實(shí)驗(yàn)室檢測組織樣品先去除包膜和其他結(jié)緒組織，選取內(nèi)部實(shí)質(zhì)部分，置研缽中，加入石英砂充分研磨，然后按照1:5比例加入0.1mol/LPBS(pH7.6-pH7.8)。4℃浸泡過夜或者-20℃反復(fù)凍融2次，每次30min,4℃條件下以8000g離心5min,取上清進(jìn)行后續(xù)操作。液體樣品如血液、尿液、唾液不必經(jīng)過研磨或凍融處理，直接進(jìn)行后續(xù)操作。不能立即進(jìn)行檢測3時，樣本凍存于-70℃左右超低溫冰箱備用。8.2.2病毒核酸提取取滅菌的1.5mL離心管，做好標(biāo)識。每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL,再加人200pL三氧甲烷，緊蓋離心管，混勻器上振蕩混勻15s后室溫靜置5min,于4℃12000g離心15min。取新的滅菌的1.5mL離心管，加入-20℃預(yù)冷400L異丙醇，吸取離心后將各管中的上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的異丙醇中，避免吸出中間層，顱倒混勻。于4℃12000g離心15min,棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干液體，加入600μL75%預(yù)冷乙醇，顛倒洗滌。于4℃12000g離心10min,棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干液體，室溫干燥5min~10min。加入15μL~20μLDEPC水，溶解管底的RNA,5000g離心5s,冰上保存?zhèn)溆?，若長期保存應(yīng)放8.2.2.2核酸提取等效方法埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取試劑及方法，如采用商品化試劑盒或自動化核酸抽提儀和配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸抽提。8.2.3陽性對照、陰性對照和空白對照檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照為根據(jù)埃博拉病毒核苷酸序列通過基因合成、載體構(gòu)建和體外轉(zhuǎn)錄合成的RNA.以及包含埃博拉病毒NP或GP基因的假病毒，陰性對照可選擇其他類病毒的核酸樣本，空自對照為無菌水作為擴(kuò)增模板。8.2.4RT-PCR檢測方法8.2.4.1檢測引物上游引物NPF75-GAGTATGCTCCTTTCGC-3'下游引物NPR:5'-TTIGGTATTCGCCGTAG-3'GP基因擴(kuò)增引物：上游引物GPF:5'-GCAACTGCGAAGAGGAG-3'下游引物GPR:5'-CACGGGTGTATTATGGCT-3'引物工作濃度均為10μmoVL,配制后于-20℃左右保存。擴(kuò)增目的基因片段長度分別為NP基因538bp、GP基因396bp。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物參考序列見附錄C。在冰盒上配制20L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。在0.2mL離心管中依次加入：DEPC處理水6.5μL,隨機(jī)引物(25μmol/L)2μL,dNTPs照5μL?；靹?，短暫離心，65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。然后在上述反應(yīng)管中加人：5x逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μL,RNA酶抑制劑(40U/pL)0.5μL,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(200UpL)1μL。緩慢混勻。按以下程序進(jìn)行cDNA合成：30℃10min,42℃45min;95℃5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰上冷卻。合成的cDNA可立即用于PCR擴(kuò)增，或保存于-20℃?zhèn)溆谩？刹捎猛饶孓D(zhuǎn)錄效率的商品化逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。4可采用同等逆轉(zhuǎn)錄效率的商品化一步法RT-PCR試劑盒。在PCR反應(yīng)管中依次加人：去離子水33μL,10×TagDNA聚合酶緩沖液(不含Mg)5μLTagDNA聚合酶(5UHL正，合成的cDNA5μL?；靹颍糜赑CR儀中。按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃5min;(95℃1min,55℃1min,72℃1min)35個循環(huán)；72℃10min。8.2.4.4瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖凝膠，加入適量的電泳核酸染料。分別取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1pL6×載樣緩沖液混勻后加入樣品孔，使用DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物作為電泳參照。置于水平電泳儀上5V/cm電泳，當(dāng)載樣緩沖液中溴酚藍(lán)指示劑色帶遷移至瓊脂糖凝膠的2/3處時停止電泳，用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增結(jié)果。8.2.4.5結(jié)果判定用凝膠成像系統(tǒng)分析，NP基因陽性對照擴(kuò)增出一條大小為538bp的特異性條帶，GP基因陽性對照擴(kuò)增出一條大小為396bp的特異性條帶，陰性對照和空白對照無特異性條帶；在陰性對照和陽性對照成立的情況下，如被檢樣品無條帶，則結(jié)果為陰性，如被檢樣品有條帶，且與陽性對照一致大小，即判定為埃博拉病毒核酸陽性。對于檢測陽性的樣本可切下電泳分析的目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化(按其說明書進(jìn)行),進(jìn)行測序確認(rèn)病毒基因序列。8.2.5實(shí)時熒光RT-PCR方法8.2.5.1引物和探針用于檢測NP基因的弓物和探針：上游引物NP-FQ:S'-TTCCCTTTCCAGGACCCATC-3'下游引物NP-RQ:5-TCGGGAATCGTCGTATCCTG-3°探針NP-P:5'-FAM-CCTGGCCATCAAGATGATGATCCGAC用于檢測GP基因的引物和探針：上游引物GP-FQ:5'-AGCTGTATCAAACCGACCCA-3°下游引物GP-RQ:5'-CTCGTGGAGATTGTGGCAAG-3'探針GP-P:5'-FAM-CGCGCCGGACTCTGACCACT-BHQi-3'引物和探針的工作濃度均為10μmol/L,配制后于-20℃左右保存。實(shí)時熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物參考序列見附錄D。8.2.5.3實(shí)時熒光PCR采用20μL反應(yīng)體系：熒光PCR預(yù)混液(2x)10μL,探針0.6L,上、下游引物各0.4μL,cDNA模板1L,RNasefreeH?O補(bǔ)足20pL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min,95℃變性10s,58℃530s,40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束時進(jìn)行熒光信號的采集。檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和C值判定結(jié)果。8.2.5.4結(jié)果判定及報告本方法檢驗(yàn)結(jié)果判定及報告如下?！獧z測樣本有明顯的熒光增幅曲線，且C值≤35時，判為陽性，報告“檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時熒光RT-PCR法?！獧z測樣本熒光增幅曲線的C值介于35和40之間時，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，若重新檢測的Ct值仍介于35和40之間。且曲線有明顯的對數(shù)增長期，判為陽性，報告“檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時熒光RT-PCR法；否則判為陰性，報告“未檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時熒光RT-PCR法”?！獧z測樣本熒光增幅曲線的C值介于40和45之間時，可采用膜過濾法濃縮核酸樣本，再重新進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測。若重新檢測的Ct值有明顯減少趨勢。且曲線有明顯的對數(shù)增長期。判為陽性，報告“檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時熒光RT-PCR法)。此類樣本建議采用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證；否則判為陰性，報告“未檢出埃博拉病毒核酸(實(shí)時熒光RT-PCR法”。埃博拉出血熱埃博拉出血熱(Eholahaemorhagicfever,EHF)是一種人獸共患病，是由絲狀病毒科的埃博拉病毒(Eholavius,EBOV)導(dǎo)致人和非人靈長類動物(如猩猩和猴子)發(fā)生急性感染的烈性出血性傳染病，人感染后死亡率高達(dá)50%-90%。A2傳染源及宿主動物hat),尤其是活躍在撒哈拉以南的非洲(包括幾內(nèi)亞)的3類水果蝙蝠——無尾肩章果蝠(Epomopsfrangueri)、錘頭果蝠(Hypsignathusmonstosus)和小領(lǐng)果蝠(Myonycteristoryurta)被認(rèn)為是埃博拉病毒可能的自然宿主。受病毒感染的果蝠通過直接或間接的方式與其他動物接觸來散播病毒，導(dǎo)致人類和非人靈長類動物如大猩猩、黑猩猩、恒河猴、獼猴的大規(guī)模流行。有研究發(fā)現(xiàn)在中非倉鼠和尖鼠體內(nèi)檢測到埃博拉病毒核酸，標(biāo)志著嚙齒類動物也有可能是儲存宿主。另外，豬和犬是至今為止確定能感染埃博拉病毒的家畜。此外，有報道來自非洲熱帶叢林中的森林玲羊和豪豬感染埃博拉出血熱情況。潛在媒介調(diào)查中，在節(jié)肢動物包括臭蟲、半翅類昆蟲等體內(nèi)未檢測發(fā)現(xiàn)有埃博拉病毒。A.3臨床癥狀早期癥狀為起病急，突然高熱、極度乏力則烈頭痛、咽喉痛，全身肌肉和關(guān)節(jié)疼痛，可能還有寒顫和精神萎靡等。隨后可出現(xiàn)嚴(yán)重的度內(nèi)疼痛、惡心、吐逆和瀉肚等消化系統(tǒng)病狀。發(fā)病4d-5d后進(jìn)入極期，患者主要表現(xiàn)為持續(xù)高燒。全身感染中毒癥候和消化道病癥更加嚴(yán)重，并伴有不同水平的出血現(xiàn)象，包含口鼻、結(jié)膜，腸胃、陰道和肌膚等部位出血，也見嘔血和血尿等，多數(shù)患者可在面、頸、軀干和手臂等部位出現(xiàn)彌漫性紅斑樣丘疹，這是區(qū)別于其他類似疾病的癥狀。特重者可出現(xiàn)意識窒礙(如譫妄、嗒順)、休克、多器官衰竭及致死性并發(fā)癥等。A.4病理變化埃博拉