畢業(yè)答辯模板廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院

微生物與生化藥學(xué)陳靜

甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化微生物生物轉(zhuǎn)化概述甾體類藥物概述甾體類藥物生物轉(zhuǎn)化類型甾體類藥物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程微生物轉(zhuǎn)化微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)(底物)轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)(產(chǎn)物)的過程，這一過程是由某種微生物產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催化劑進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)言之，即為一種利用微生物酶或微生物本身的合成技術(shù)。微生物轉(zhuǎn)化在生產(chǎn)工藝上有如下特點(diǎn):①可減少化學(xué)合成步驟，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，縮短生產(chǎn)路線。

②能提高產(chǎn)物的收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。③可進(jìn)行化學(xué)法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)。④

微生物轉(zhuǎn)化避免和減少了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或化學(xué)有毒物質(zhì)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。第一節(jié)概述甾類激素是指分子結(jié)構(gòu)中含有環(huán)戊烷多氫菲核的一類藥物。甾體化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖甾類激素根據(jù)其生理活性可分為腎上腺皮質(zhì)激素、性激素和蛋白同化激素三大類。

在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用非常廣泛，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、控制炎癥、哮喘病、皮膚病、避孕、利尿等各方面的治療上，對(duì)機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。甾體化合物結(jié)構(gòu)甾體化合物編號(hào)甾體類激素藥腎上腺皮脂激素類可的松、強(qiáng)的松、氫化可的松

功能：抗炎、抗毒、抗過敏對(duì)風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等有治療作用。生殖腺激素孕酮、雌酮

功能：調(diào)節(jié)內(nèi)分泌人工合成避孕藥長(zhǎng)效孕酮等早期甾類激素藥物的生產(chǎn)主要靠化學(xué)合成。脫氧膽酸--醋酸可的松甾體激素類藥物生產(chǎn)新的途徑——微生物轉(zhuǎn)化。少根根霉及黑根霉能使黃體酮轉(zhuǎn)化成11α-羥基黃體酮，收率達(dá)85％。細(xì)菌、酵母、霉菌和放線菌的某些種類都可能使甾類化合物的一定部位發(fā)生有價(jià)值的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，微生物轉(zhuǎn)化已成為甾體工業(yè)中不可缺少的部分，在生產(chǎn)中常采用化學(xué)合成與微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的辦法。

第二節(jié)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型

對(duì)甾體激素藥物合成比較重要的主要有:氧化反應(yīng):其中氧化反應(yīng)又包括甾體骨架上的羥基化和脫氫(生成雙鍵)、甾醇氧化成甾酮、支鏈降解作用以及D環(huán)的切斷和D環(huán)開裂形成內(nèi)酯環(huán)等。還原反應(yīng)水解反應(yīng)

一、羥化反應(yīng)

通過微生物羥化酶能非常專一地選擇某個(gè)碳位置上將某空間位置上的氫取代氧化成原來空間構(gòu)型的羥基。1．C9α羥化2．C11α羥化

C11α羥化是微生物轉(zhuǎn)化的特有反應(yīng)，人體內(nèi)的酶也不能將甾體C11α羥化。在C11α羥化菌株中，以黑根霉為最好利用微生物轉(zhuǎn)化的方法實(shí)現(xiàn)、C11β、

C16α

、C17α和C19α位的羥化反應(yīng)，這些也是制藥工業(yè)中很有價(jià)值的反應(yīng)。進(jìn)行甾體羥基化作用的微生物轉(zhuǎn)化物質(zhì)作用位置微生物代表孕酮11

11

黑根霉、黑曲霉、臘狀桿菌等彎曲孢霉化合物S11

11

黑根霉、黑曲霉、焦曲霉構(gòu)巢曲霉假單孢桿菌、弗氏鏈霉菌、梨頭霉11脫氧皮脂酮11

彎月彎孢霉雌二醇16

巨大芽孢桿菌環(huán)糊精的生理作用

Hesselink等研究：應(yīng)用環(huán)糊于分枝桿菌甾體邊鏈的降解。環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡聚糖，一般由6－8個(gè)葡萄糖分子通過

－1，4糖苷鍵連接而成。易溶于水。含有疏水性空腔，可與疏水性分子結(jié)合。可作為幾種甾體類藥物的穩(wěn)定劑和增溶劑。環(huán)糊精的應(yīng)用實(shí)例1Chincholkar等研究了在

環(huán)糊精存在時(shí)，CurrulariaVKMF-644對(duì)11－脫氫皮甾醇（ReichsteinS化合物，簡(jiǎn)稱化合物S）的11

羥基化。在底物濃度為4g/L時(shí)：化合物S：

－CD＝1.0:0.6氫化可的松的產(chǎn)率為70％－75％無

－CD：氫化可的松的產(chǎn)率為40％－50％環(huán)糊精的應(yīng)用實(shí)例2GD：19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－雙酮經(jīng)Penicilliumraistrickii進(jìn)行15

羥基化――――口服避孕藥?5－D－十八甲基炔諾酮（gestodene）的重要中間體。Schlosser等研究表明：在

－環(huán)糊精存在時(shí)，菌株或其固定化細(xì)胞對(duì)CD的15

羥基化作用，與以甲醇做溶劑比較，其轉(zhuǎn)化率都能明顯提高。

環(huán)糊精作用

環(huán)糊精有利于提高甾體底物溶解度真菌能以

環(huán)糊精作為C源

二、環(huán)氧化反應(yīng)

用微生物轉(zhuǎn)化法在甾體母核上引入環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)。

三、脫氫反應(yīng)

當(dāng)抗炎甾體激素等藥物的母核C1、C2位置導(dǎo)入雙鍵后，其抗炎作用會(huì)成倍增加?；瘜W(xué)法脫C1、C2氫是采用二氧化硒法，由于硒在生產(chǎn)中難以除盡會(huì)使產(chǎn)品中帶有少量對(duì)人體有害的物質(zhì)，所以采用微生物轉(zhuǎn)化脫氫是甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步。微生物對(duì)甾體羥化與脫氫能力是相反的，細(xì)菌的脫氫能力比真菌大，特別以棒狀桿菌和分枝桿菌活力最大。球形芽孢桿菌、諾卡菌對(duì)可的松和皮質(zhì)醇也有較高的脫氫活力。

四、還原反應(yīng)

微生物催化的還原反應(yīng)有各種類型：有的是甾類化合物上的醛或酮基被還原成伯醇或仲醇基；也有的是甾類核的A環(huán)或B環(huán)中的雙鍵被加氫還原成飽和鍵等。

五、水解反應(yīng)

微生物進(jìn)行的水解反應(yīng)包括脫?；磻?yīng)、環(huán)氧化物的水解反應(yīng)等。

第三節(jié)甾類激素的生產(chǎn)工藝過程

甾體的微生物轉(zhuǎn)化和一般的氨基酸、抗生素的生產(chǎn)不同，發(fā)酵的產(chǎn)物不是目的產(chǎn)物，而只是利用微生物的酶對(duì)甾體底物的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來獲得一定的產(chǎn)物。整個(gè)生產(chǎn)過程，微生物的生長(zhǎng)和甾體的轉(zhuǎn)化完全可以分開。一般先進(jìn)行菌的培養(yǎng)，在菌生長(zhǎng)過程中累積甾體轉(zhuǎn)化所需要的酶，然后利用這些酶來改造分子的某一部位。為了獲得較多的酶，首先需保證菌體的充分生長(zhǎng)，但微生物的生長(zhǎng)與酶的生產(chǎn)條件不是完全一致的。

一、甾類激素生產(chǎn)的原料早期合成甾類激素的起始原料大多來自動(dòng)物的膽甾醇、膽酸等。因這些原料的來源少、含量低、成本高，不能滿足生產(chǎn)的需要。因而促使從植物中尋找起始原料并獲得成功。已經(jīng)大量投產(chǎn)的甾類原料：膽固醇、膽酸、薯蕷皂苷配基（穿龍薯蕷和盾葉薯蕷）、豆甾醇、澳洲茄堿等。二、甾類激素的微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)流程

甾體的微生物轉(zhuǎn)化通常分兩個(gè)階段：第一階段是生長(zhǎng)階段；第二階段是轉(zhuǎn)化階段大多數(shù)甾體化合物難溶于水，通常是先把底物溶于有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇、甲醇，濃度在2％時(shí)對(duì)微生物無毒性?；蛴帽砻婊钚詣?如吐溫80)來提高基質(zhì)溶解度。甾體氧化需要較大的通氣量，一般1：0.8(vvm)。甾體加入的速度隨菌種轉(zhuǎn)化能力和基質(zhì)的性質(zhì)而定，一般濃度約200～800mg／L，采用基質(zhì)的定期加入和連續(xù)加入的辦法來解決基質(zhì)或產(chǎn)物的毒性問題。轉(zhuǎn)化時(shí)間隨菌種而異，一般范圍在12～72h。轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物大多不溶于水，所以采用溶劑萃取法進(jìn)行提取。如果產(chǎn)物分泌在發(fā)酵液中，則發(fā)酵濾液采用離子交換樹脂吸附法吸附甾體化合物，洗脫后，減壓濃縮進(jìn)行結(jié)晶。二、甾體微生物轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以利用不同形式的微生物細(xì)胞，如菌體培養(yǎng)物、靜止細(xì)胞懸液、孢子懸液、混合培養(yǎng)物、固定化細(xì)胞或固定化酶等。

靜息細(xì)胞法

為了排除原培養(yǎng)基中自身的代謝產(chǎn)物對(duì)不同生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)化的影響，常常用洗滌的靜息細(xì)胞來代替發(fā)酵液中的生長(zhǎng)的細(xì)胞，即將不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞取出，洗去沾染的原培養(yǎng)液及其代謝產(chǎn)物，然后把細(xì)胞懸浮在人工轉(zhuǎn)化系統(tǒng)內(nèi)，在一定條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。優(yōu)點(diǎn)：能自由地改變反應(yīng)液中的基質(zhì)和菌體量的比例，與生長(zhǎng)培養(yǎng)法相比一般能縮短反應(yīng)時(shí)間，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)物中雜質(zhì)較少，分離提純比較容易等孢子轉(zhuǎn)化法

真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物轉(zhuǎn)化。細(xì)菌的內(nèi)生孢子（芽孢），一般無轉(zhuǎn)化活性?；旌吓囵B(yǎng)

混合培養(yǎng)進(jìn)行反應(yīng)是將具有1，2脫氫能力和11β羥化能力的微生物并用進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)?？墒÷猿樘岵僮?。

第四節(jié)氫化可的松的制備

氫化可的松又稱為皮質(zhì)醇?；瘜W(xué)名稱為11β，17a，21一三羥基孕甾-4烯-1，20-二酮。其結(jié)構(gòu)式為：氫化可的松為皮質(zhì)激素類藥物，具有影響糖代謝、抗炎、抗毒、抗休克及抗過敏等作用。主要用于腎上腺皮質(zhì)功能不足和自體免疫性疾??；應(yīng)用于某些感染的綜合治療。消化性潰瘍病、骨質(zhì)疏松癥、精神病、重癥高血壓患者忌用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。由于氫化可的松療效確切，為重要的甾體激素類藥物之一，在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的激素類藥物中產(chǎn)量最大。

1．反應(yīng)原理

2．工藝過程

將犁頭霉菌接種到土豆斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～9天，成熟孢子用無菌生理鹽水制成孢子懸液后。種子培養(yǎng)基用葡萄糖、玉米漿、硫酸銨等配制，pH值為5．8～6．3，接入孢子懸液后，在通氣攪拌下28℃培養(yǎng)28～32h。待培養(yǎng)液菌濃度達(dá)到35％以上，無雜菌污染，即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。將玉米漿、酵母膏、硫酸銨、葡萄糖及水投入發(fā)酵罐中攪拌，用NaOH調(diào)整物料pH值到5.7～6.3，加入O.03％豆油，滅菌溫度120℃

，通入無菌空氣，降溫至27～28℃

，接入犁頭霉孢子懸浮液，通氣攪拌發(fā)酵28～32h。用NaOH調(diào)pH值到5.5～6.0，投入發(fā)酵液體積0.15％的萊氏化合物S，氧化48h后，取