342微生物制藥省公開課一等獎(jiǎng)全國示范課微課金獎(jiǎng)?wù)n件

第二章微生物制藥第1頁一、微生物藥品幾個(gè)相關(guān)基本概念二、微生物藥品分類三、微生物藥品應(yīng)用四、藥源微生物及微生物藥品篩選技術(shù)五、微生物藥品發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)六、微生物藥品分離、精制和判別七、廢棄物綜合利用和環(huán)境保護(hù)第2頁四、藥源微生物及微生物藥品篩選技術(shù)（一）藥品產(chǎn)生菌（二）新藥產(chǎn)生菌分離（三）新微生物藥品篩選（四）微生物藥品產(chǎn)生菌菌種改良（五）微生物藥品產(chǎn)生菌保藏第3頁（二）新藥產(chǎn)生菌分離1、土壤微生物分離土壤是微生物主要棲息地。（1）采集樣品（2）分離微生物（3）選留菌種及保留分離放線菌樣品除土壤以外，還有河（湖、海）泥和水、枯樹葉、堆肥、動(dòng)物糞便等。土壤樣品通常采表層土（5cm以下），樣品以未開墾過土壤為佳，要盡可能選擇不一樣地理和生態(tài)環(huán)境土壤。

第4頁1、土壤微生物分離（1）采集樣品（2）分離微生物（3）選留菌種及保留樣品處理分離培養(yǎng)基抑制劑使用分離方法培養(yǎng)條件稀有放線菌選擇性分離其它微生物分離第5頁利用放線菌孢子和細(xì)菌營養(yǎng)細(xì)胞及不一樣屬間放線菌孢子間耐性差異，用物理或化學(xué)方法除去細(xì)菌及目標(biāo)外放線菌，或者用花粉作為誘餌，增加一些特定放線菌分出率。分離前樣品加熱處理處理?xiàng)l件樣品分離放線菌40℃，2～16h土壤、植物根鏈霉菌55℃，6min水、土壤、糞便小單孢菌、鏈霉菌、紅球菌、嗜酸放線菌和嗜堿放線菌等55℃干熱，10d土壤高溫放線菌100℃干熱，15min土壤馬杜拉放線菌100～120℃干熱，1h土壤馬杜拉放線菌、小雙孢菌，小四孢菌，孢囊鏈霉菌樣品處理A）溫度第6頁B）化學(xué)試劑處理SDS-酵母膏處理法，SDS對放線菌孢子基本無害，酵母浸膏以及溫和熱休克能夠促進(jìn)放線菌孢子出芽，使細(xì)菌數(shù)顯著降低。風(fēng)干土壤與CaCO3混合后在26℃培養(yǎng)7～9d，然后分離放線菌。風(fēng)干土壤降低了細(xì)菌數(shù)量，CaCO3有利于放線菌生長而不利于絕大多數(shù)真菌生長。用0.01mol/LNaOH處理土壤5～10min（15℃）可降低細(xì)菌數(shù)量，有利于分離小單孢菌。用1.4%酚處理土樣10min或用1.4%酚130℃處理30min，分別有利于取得鏈霉菌或小單孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯處理樣品，過濾風(fēng)干后用來分離微生物，能夠除去樣品中真菌。第7頁C）物理方法處理離心，1600g離心20min，上清液主要有放線菌孢子，沉淀含有細(xì)菌和真菌孢子。超聲波處理，分離小單孢菌和鏈霉菌。特殊器具捕集空氣中游離孢子，分離糖多孢菌。攪動(dòng)，使干草上孢子脫落，用于從干草中分離高溫放線菌。膜過濾，將水經(jīng)膜（孔徑0.45濾膜）過濾，濃縮水中微生物，再將膜直接貼在瓊脂平板上培養(yǎng)。誘餌法，在培養(yǎng)基中添加特殊物質(zhì)，如花粉、蛇皮、頭發(fā)等，可分離小瓶菌和發(fā)仙菌。第8頁分離培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基——精氨酸培養(yǎng)基，高氏合成一號培養(yǎng)基，天門冬素培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基等有機(jī)培養(yǎng)基——Waksman培養(yǎng)基，Bennett培養(yǎng)基幾丁質(zhì)培養(yǎng)基——只有放線菌能夠利用幾丁質(zhì)，生長菌落小，白色，需轉(zhuǎn)接到產(chǎn)可溶性色素適當(dāng)培養(yǎng)基上加以區(qū)分HV培養(yǎng)基——以土壤腐殖質(zhì)為唯一碳源和氮源培養(yǎng)基總要求：盡可能使樣品中全部放線菌都生長出來，而其它微生物（細(xì)菌和真菌）又盡可能不長。第9頁選擇性分離放線菌所使用培養(yǎng)基待分離放線菌所用固體培養(yǎng)基中主要成份馬杜拉放線菌屬葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量鹽，維生素（AV培養(yǎng)基）小雙孢菌屬AV培養(yǎng)基小單孢菌屬微量鹽，丙酸鈉，硫胺素（M3培養(yǎng)基）小四孢菌屬下層：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量鹽上層：（水解）酪蛋白氨基酸諾卡菌屬微量鹽，丙酸鈉，硫胺素（M3培養(yǎng)基）嗜高溫放線菌屬半濃度營養(yǎng)瓊脂鏈孢囊菌屬葡萄糖，L-天冬胺酰，微量鹽（NH2），維生素，土壤浸出液各種菌屬膠體幾丁質(zhì)，微量鹽第10頁抑制劑使用加入抗真菌試劑（制霉菌素、兩性霉素B、放線菌酮、丙酸鈉以及使真菌形成較小菌落rosebengal等），抑制真菌生長；加入抗細(xì)菌抗生素（青霉素、鏈霉素）抑制細(xì)菌生長，增加放線菌分出率；加入一些抗生素也可抑制部分放線菌，有利于分離到一定種類放線菌。如新生霉素有利于分離北里孢菌屬。第11頁分離方法稀釋法干土噴射法孢子飛揚(yáng)法濾膜法——最慣用，將土壤樣品用無菌水（或生理鹽水、磷酸緩沖液）制成懸液，倍比稀釋，涂布平板，恒溫培養(yǎng)?！脟娡翙C(jī)或其它方法將風(fēng)干碾細(xì)土樣直接噴在分離平板上?！獙?.22~0.45μm濾膜放在分離平板上，接種菌懸液或噴撒干土，適溫培養(yǎng)一段時(shí)間，放線菌菌絲可穿過濾膜小孔生長到培養(yǎng)基上，細(xì)菌只能在濾膜表面生長，去掉濾膜，深入培養(yǎng)基放線菌經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后長出菌落。——將樣品置于特制瓶中，其瓶口剛好能倒置一個(gè)分離平板，猛烈振蕩使孢子飛揚(yáng)，撞到分離平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。第12頁培養(yǎng)條件普通培養(yǎng)溫度為25~30℃，也有32~37℃，培養(yǎng)7～14d，生長慢放線菌可延長培養(yǎng)1個(gè)月；分離高溫放線菌用45～50℃培養(yǎng)1～2d；海水放線菌用20℃培養(yǎng)6周左右。第13頁稀有放線菌選擇性分離稀有放線菌特征：生長速度比較遲緩；營養(yǎng)需求較為復(fù)雜；比較缺乏孢子分化能力；不能穩(wěn)定保留。第14頁分離幾個(gè)稀有放線菌方法待分離稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法特征馬杜拉放線菌100℃加熱15min，并懸浮于無菌25％（V/V）Ringer’s溶液中懸浮液涂布于含有100μg/mL放線菌酮、25μg/mL利福平固體培養(yǎng)基上高溫處理土樣與使用含有利福平固體培養(yǎng)基相結(jié)合選擇性分離方法游動(dòng)放線菌不形成真正氣生菌絲，而且菌落呈鮮艷橘黃色。營養(yǎng)菌絲上形成孢子囊。游動(dòng)孢子由成熟孢子囊產(chǎn)生。土樣浸泡于飽和硫酸鎂鹽溶液中，再洗去鎂鹽，干燥土樣。將經(jīng)過干濕處理后土樣涂布于幾丁質(zhì)瓊脂上，可得到大量游動(dòng)放線菌利用了生物趨化方法小單孢菌大多數(shù)種缺乏氣生菌絲，形成橘黃色或橘紅色菌落孢子；分化菌落表面變成黑色或暗褐色，有時(shí)呈光滑或粘稠。單孢子只在營養(yǎng)菌絲上形成，沒有運(yùn)動(dòng)性。堿處理有效降低了革蘭氏陰性細(xì)菌生長含有衣霉素固體培養(yǎng)基可選擇性支持小單孢菌生長將土樣進(jìn)行堿處理和使用含有衣霉素固體培養(yǎng)基相結(jié)合獨(dú)特方法第15頁分離幾個(gè)稀有放線菌方法待分離稀有放線菌種類形態(tài)特征預(yù)處理方法分離方法分離方法特征諾卡菌大多數(shù)種形成臘樣或有光澤菌落而不形成氣生菌絲，但也有一些種會(huì)產(chǎn)生不成熟氣生菌絲，營養(yǎng)菌絲可斷裂成球狀或桿狀片斷用石蠟棒在土壤樣品懸液中富集然后將石蠟從棒上剝離，接種到DST（Oxoid）瓊脂平板上，25℃培養(yǎng)3w鏈孢囊菌營養(yǎng)和氣生菌絲與鏈霉菌菌株一樣發(fā)育良好，包含著不能移動(dòng)孢子孢囊位于氣生菌絲頂端可先將土樣在室溫風(fēng)干，然后在120℃加熱1h將處理后土樣或用土壤懸液涂布于含有維生素培養(yǎng)基上北里孢菌屬形態(tài)特征以及菌落特征與鏈霉菌屬非常相同，但它們細(xì)胞壁中含有LL-DAP、meso-DAP、甘氨酸、半乳糖，與鏈霉菌屬完全不一樣50μg/mL新生霉素培養(yǎng)基利用了北里孢菌屬菌種對新生霉素含有抗性特征第16頁其它微生物分離真菌分離慣用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Martin培養(yǎng)基、察氏蔗糖（葡萄糖）瓊脂培養(yǎng)基，pH偏酸性。為了抑制細(xì)菌生長普通在分離培養(yǎng)基中加入β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類等抗生素。細(xì)菌分離慣用有機(jī)培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂加氨基酸維生素培養(yǎng)基等，pH偏堿性。分離時(shí)普通加入一定量抗真菌抗生素如制霉菌素、兩性霉素、放線菌酮等，抑制真菌生長，有利于細(xì)菌分離。加入多粘菌素可大大降低G－細(xì)菌生長，使G＋細(xì)菌得以富集。第17頁1、土壤微生物分離（1）采集樣品（2）分離微生物（3）選留菌種及保留將菌株優(yōu)良特征保留下來，保持微生物活力。低溫保藏法傳代培養(yǎng)保藏法液體石蠟保藏法沙土保藏法冷凍干燥保藏法第18頁2、海洋微生物分離第19頁Okami等從海洋中分離放線菌程序①目標(biāo)從海水和海底沉淀物中分離放線菌②分離樣品用采樣器采集海水和海底沉淀物③前處理離心和過濾海水抵達(dá)濃縮，沉淀物直接涂平板④培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基，包含含人造海水一些培養(yǎng)基（淀粉－水解酪蛋白－海水）⑤培養(yǎng)20℃，6w⑥挑選菌落挑出全部放線菌菌落⑦結(jié)果有幾株產(chǎn)生新抗生素菌種，包含沉淀物中得到產(chǎn)生aplasmomycinStr.griseus第20頁分離海洋放線菌培養(yǎng)基：（1）SC培養(yǎng)基：（2）Z培養(yǎng)基：（3）普通分離放線菌培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，再加入人造海水可溶性淀粉10g酪蛋白1g人造海水500ml蒸餾水500ml瓊脂1.7%pH7.4蛋白胨5g磷酸鐵0.1g酵母膏1g人造海水1000ml瓊脂1.7%pH7.6第21頁3、極端微生物分離極端微生物是在特殊環(huán)境（如高溫、低溫、高鹽、高堿、高壓等）中形成一類特殊微生物，因而在分離這類微生物時(shí)，需考慮它們生長繁殖所需特殊條件，以設(shè)計(jì)分離與培養(yǎng)條件。分離嗜熱微生物，有些菌株最適生長溫度高達(dá)80℃，pH在1－6；分離嗜鹽微生物時(shí)培養(yǎng)基中鹽濃度可高達(dá)2.5mol/L。第22頁4、其它微生物資源粘細(xì)菌基因重組微生物利用基因工程技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)生新次級代謝產(chǎn)物基因重組微生物，逐步創(chuàng)建組合生物合成。利用基因重組微生物提升已經(jīng)有抗生素產(chǎn)量和有效組分含量。纖維素堆囊菌（Sorangiumcellulosum）——大環(huán)內(nèi)酯類抗生素堆囊菌素，—琥蒼菌素（抗真菌）第23頁組合生物合成——將產(chǎn)生不一樣抗菌藥品或其它生理活性中間