KTA0002-CN-Annexin V-AbFluor 488 PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

AnnexinV-AbFluor?488/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Cat:KTA0002 Size:20T/50T/100T AnnexinV-AbFluor?488/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 貨號(hào)：KTA0002 批號(hào)：見產(chǎn)品標(biāo)簽 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)：適用于細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡檢測 熒光激發(fā)/發(fā)射：AnnexinV-AbFluor?488:Ex/Em=491/517nm,PI:Ex/Em=535/617nm 保質(zhì)期：-20℃，避光保存12個(gè)月原理凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，它能從組織中清除不需要的、受損的或衰老的細(xì)胞。在正常細(xì)胞中，負(fù)性磷脂位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，而膜的外表面則被不帶電的磷脂（PS）所占據(jù)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)后，帶負(fù)電的PS從質(zhì)膜的內(nèi)葉向外葉運(yùn)輸，使PS暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。人抗凝血?jiǎng)〢nnexinV是一種35-36kDaCa2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高度親和力。AnnexinV標(biāo)記有熒光團(tuán)或生物素，可通過與外葉PS結(jié)合識(shí)別凋亡細(xì)胞。碘化丙啶（PI）是一種熒光核染料，對(duì)活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞不敏感，但對(duì)死細(xì)胞有紅色熒光染色，與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合緊密。AnnexinV-AbFluor?488/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為細(xì)胞凋亡提供了一種快速簡便的檢測方法。在提供的結(jié)合緩沖液中，用AnnexinV-AbFluor?488和PI染色細(xì)胞群后，早期凋亡細(xì)胞顯示細(xì)胞膜綠色熒光，死細(xì)胞顯示細(xì)胞核紅色熒光和細(xì)胞膜綠色熒光?；罴?xì)胞幾乎沒有熒光。此外，針對(duì)凋亡檢測和結(jié)果的非標(biāo)準(zhǔn)化問題，本試劑盒還提供專利的細(xì)胞凋亡陽性對(duì)照品。檢測可通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行分析。包裝清單試劑盒組分 規(guī)格 儲(chǔ)存條件 20T 50T 100T AnnexinVBindingBuffer(5×) 2mL 5mL 10mL -20℃AnnexinV-AbFluor?488 100μL 250μL 500μL -20℃，避光保存PropidiumIodide(PI) 40μL 100μL 200μL -20℃，避光保存ApoptosisInducerA 5μL 5μL 10μL -20℃ApoptosisInducerB 5μL 5μL 10μL -20℃自備耗材·離心機(jī)、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、去離子水、載玻片·細(xì)胞培養(yǎng)孔板試劑準(zhǔn)備注意：各組分開蓋前，請(qǐng)先低速離心。1×AnnexinVBindingBuffer：臨用前配置，用去離子水把AnnexinVBindingBuffer(5×)稀釋成1×AnnexinVBindingBuffer；未用完的試劑4℃可保存6個(gè)月。AnnexinV-AbFluor?488：即用型；使用前，平衡到室溫；未用完的試劑分裝后-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。PropidiumIodide(PI)：即用型；使用前，平衡到室溫；未用完的試劑分裝后-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。ApoptosisInducerA：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。ApoptosisInducerB：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)胞凋亡陽性誘導(dǎo)1.對(duì)于待誘導(dǎo)凋亡的培養(yǎng)細(xì)胞，分別按照與細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比1:1,000-1:3,000的比例把ApoptosisInducerA或ApoptosisInducerB加入到培養(yǎng)液中（也可將ApoptosisInducerA和ApoptosisInducerB同時(shí)加入培養(yǎng)液中）。2.在4、8、12、16或24h后觀察細(xì)胞凋亡的情況。通常16-24h后，在光學(xué)顯微鏡下可以看到明顯的細(xì)胞形態(tài)的變化，此時(shí)可以用于細(xì)胞凋亡染色觀察（不同細(xì)胞可按實(shí)際情況調(diào)整誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間）。二、AnnexinV-AbFluor?488/PI細(xì)胞凋亡檢測A.流式細(xì)胞儀分析1.通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)培養(yǎng)無誘導(dǎo)的對(duì)照培養(yǎng)物。2.4℃，300g離心5min收集1-2×105細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次。注意：貼壁細(xì)胞使用胰酶（不含EDTA）消化后離心收集細(xì)胞，消化時(shí)間如果過長，易造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽性，所以需控制胰酶消化時(shí)間。3.用500μL1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞。4.每500μL細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-AbFluor?488和2μLPI，輕柔混勻。5.室溫避光孵育15min。6.孵育結(jié)束后后置于冰上。染色后30min內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。使用491nm和535nm激發(fā)，517nm（FITC通道）和617nm（PE或PI通道）附近測量熒光。B.熒光顯微鏡分析1.對(duì)于懸浮細(xì)胞：1）按照步驟A.1到步驟A.6的流式細(xì)胞分析步驟。2）將步驟A.6的細(xì)胞懸浮置于玻片上，用蓋玻片蓋住細(xì)胞。盡快使用適當(dāng)?shù)臑V鏡通過熒光顯微鏡分析細(xì)胞（AnnexinV-AbFluor?488可以使用FITC設(shè)置拍照，PI可以使用Cy?3或TexasRed?設(shè)置拍照）。2.對(duì)于貼壁細(xì)胞，按照以下操作步驟：1）細(xì)胞接種于爬片或腔室載玻片上，培養(yǎng)細(xì)胞。2）通過所需方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)培養(yǎng)無誘導(dǎo)的對(duì)照培養(yǎng)物。3）除去培養(yǎng)基，用預(yù)熱或者室溫的PBS洗滌細(xì)胞2次。4）準(zhǔn)備工作液：每100μL1×AnnexinVBindingBuffer添加5μLAnnexinV-AbFluor?488和2μLPI，輕柔混勻。5）在細(xì)胞中加入適量的工作液（確保工作液完全覆蓋細(xì)胞），室溫避光孵育15min（可以在冰上孵育，以減緩凋亡過程，但孵育時(shí)間需延長到至少30min）。6）用1×AnnexinVBindingBuffer洗滌細(xì)胞2次。注意：此步不要使用PBS洗滌細(xì)胞。7）載玻片上添加一滴1×AnnexinVBindingBuffer，然后將細(xì)胞爬片置于玻片上。對(duì)于細(xì)胞腔室載玻片上的細(xì)胞，添加足夠的1×AnnexinVBindingBuffer覆蓋細(xì)胞。注意：也可使用抗熒光淬滅封片劑封片。8）使用適當(dāng)?shù)臑V光片在熒光顯微鏡下分析細(xì)胞。草莓時(shí)刻：除了基于細(xì)胞膜的變化檢測細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體的變化也能反映細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞質(zhì)的變化主要有Caspase（KTA3020，KTA3023）的表達(dá)變化；線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件（KTA4001）；TUNEL法是基于細(xì)胞核斷裂檢測細(xì)AnnexinV-AbFluor?488/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒胞凋亡的經(jīng)典方法（KTA2010，KTA2011)。掃描右側(cè)二維碼，關(guān)注Abbkine公眾號(hào)，了解更多Abbkine產(chǎn)品信息。 結(jié)果展示Figure1.Hela細(xì)胞用本試劑盒誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)經(jīng)AnnexinV-AbFluor?488/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色后檢測的凋亡效果圖。FAQ1．孵育結(jié)束后加入，做流式可以不加1×AnnexinVBindingBuffer嗎？可以，加入1×AnnexinVBindingBuffer的體積是根據(jù)流式細(xì)胞儀要求的上樣體積來確定，如果細(xì)胞孵育懸液的體積足夠，可以不加入該Buffer來補(bǔ)齊體積。2．試劑盒陽性對(duì)照如何設(shè)置？根據(jù)說明書用試劑盒內(nèi)提供的陽性試劑進(jìn)行陽性誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，如果誘導(dǎo)效果不明顯，建議選用其它誘導(dǎo)劑（如喜樹堿）進(jìn)行誘導(dǎo)。3．在加入100μLAnnexinV結(jié)合緩沖液后，可不可以等到60min左右再去做下一步呢?因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)是活細(xì)胞染色，先染完第一種染料，如果間隔時(shí)間太長，細(xì)胞活力會(huì)受到影響。推薦產(chǎn)品 貨號(hào) 品名 推薦原因KTA2010 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光） 檢測細(xì)胞和組織的細(xì)胞凋亡KTA2011 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（紅色色熒光） 檢測細(xì)胞和組織的細(xì)胞凋亡KTA4001 線粒體膜電位分析試劑盒（JC-1） 膜電位變化反映細(xì)胞凋亡KTA3022 Caspase-3活性分析試劑盒（比色法） Caspase-3活性反映細(xì)胞凋亡KTA3026 Caspase-9活性分析