THXCY 99-2024 紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01B20團體 標(biāo)準(zhǔn)T/HXCY99-2024紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程TechnicalRegulationsforHighThroughputGenotypeIdentificationandAnalysisofAlfalfa2024-12-21布 2024-12-24北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟發(fā)布1IIT/HXCY99—2024目 次前 言 II范圍 1規(guī)性用件 1術(shù)和義 1技原理 1儀設(shè)備 2測方法 3生信分析 4測報告 5IIIIT/HXCY99—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本標(biāo)準(zhǔn)由北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟提出并歸口。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。T/HXCY99—2024T/HXCY99—2024PAGEPAGE1紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了紫花苜蓿（MedicagosativaL.）高通量基因型鑒定分析的技術(shù)原理、儀器設(shè)備、測試方法、生物信息分析和測試報告。本文件適用于紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析。規(guī)范性引用文件包括GB/T30989GB/T40171DNAT/JSFT/JSF001美洲黑楊性別苗期鑒定技術(shù)規(guī)程——SSR分子標(biāo)記法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。DNAlibrary將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細胞，進行克隆，這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫。探針probe識別特定堿基序列，經(jīng)人工標(biāo)記的小段單鏈核酸分子。high-throughputsequencing100Mb引物primerDNADNApolymerase它是以親代DNA為模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類酶。DNADNAligase在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組過程中，能夠催化DNA鏈之間的磷酸二酯鍵形成的酶。SNPSNPmarker在基因組上由單個核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記。liquid-phasegenechip靶向測序分型技術(shù)GenotypingbyPinpointSequencingofliquidcapturedtargets（cGPS）SNP/InDel技術(shù)原理SNP/InDel儀器設(shè)備PCR儀PCR儀ArraySNPline測試方法DNA提取與質(zhì)控NBT3089執(zhí)行；使用QubitDNA1%DNA5010ng/μL；6.1.4OD260/280應(yīng)為1.8~2.0，OD260/230不小于1.8的樣品宜用于文庫制備。cGPS文庫構(gòu)建與質(zhì)控利用酶切試劑將DNA樣品酶切成100~500bpTaq3’A使用T4DNA后的產(chǎn)物使用Qubit連接產(chǎn)物進行PCRQubit熒光定量儀檢測濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段；200ng質(zhì)檢合格的PCRRNA（RnaseBlock）5016~24h完成30~60minPCRcGPS上機測序文庫構(gòu)建完成后，應(yīng)利用Qubit熒光定量儀對文庫濃度測定，采用Agilent2100/2200Bioanalyzer檢測文庫質(zhì)量，文庫片段宜250~500bp。文庫質(zhì)檢合格后，按測序平臺標(biāo)準(zhǔn)進行上樣及測序。生物信息分析測序數(shù)據(jù)質(zhì)控測序數(shù)據(jù)質(zhì)控測序數(shù)據(jù)格式測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件應(yīng)通過堿基識別（BaseCalling）分析轉(zhuǎn)化為測序序列原始數(shù)據(jù)過濾（Rawfastp低質(zhì)量的Reads，得到高質(zhì)量的CleanReads測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Phred（Phredscore，Qphred）堿基分布檢查應(yīng)用于檢測AT、GC分離現(xiàn)象。G和C堿基及A和T堿基含量在每個測序循環(huán)上應(yīng)分別對等，且測序過程應(yīng)穩(wěn)定不變，呈水平線。7.1.57.1.5測序數(shù)據(jù)污染檢測每個樣品的fastq文件中隨機選擇1萬條序列，利用Blastn將序列比對到NCBInr/nt數(shù)據(jù)庫對污染評估。參考基因組比對BWACleanReads4號”等紫花苜蓿參考基因組比對，定位CleanReads60K目標(biāo)位點變異分析DNASNP、InDelCleanReads工具HaplotypeCaller對靶向位點基因型檢測；利用組中發(fā)生的區(qū)域，包括內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)、編碼區(qū)、5’端UTR區(qū)、3’端UTR區(qū)等，以及變異產(chǎn)生的同義、非同義突變等影響。測試報告測試報告應(yīng)包括下列內(nèi)容：—樣本信息；—靶向測序基因型分型技術(shù)；