TSHQAP 018-2024 人真皮成纖維細(xì)胞

ICS07.080CCSC27團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/SHQAP018—2024人真皮成纖維細(xì)胞Humandermalfibroblast2024-12-27發(fā)布 2025-01-27實(shí)施上海市醫(yī)藥質(zhì)量協(xié)會(huì)??發(fā)布T/SHQAP018T/SHQAP018—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語(yǔ)和定義 1縮略語(yǔ) 1原材料和輔料 2制備的一般要求 2技術(shù)要求 2檢驗(yàn)方法 3檢驗(yàn)規(guī)則 3標(biāo)簽 4包裝、儲(chǔ)存及運(yùn)輸 4廢棄物處理 4附 錄 A （資料性）細(xì)胞存活率檢測(cè) 細(xì)胞計(jì)數(shù)法 5附 錄 B （規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測(cè) 流式細(xì)胞法 6附 錄 C （規(guī)范性）細(xì)胞功能指標(biāo)檢測(cè) ELISA法 8附 錄 D （規(guī)范性）人成纖維細(xì)胞成瘤性檢測(cè) 裸鼠皮下接種法 9前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由上海市醫(yī)藥質(zhì)量協(xié)會(huì)提出。本文件由上海市醫(yī)藥質(zhì)量協(xié)會(huì)歸口。（上海（上海有限公（上海（上海T/SHQAP018T/SHQAP018—2024PAGEPAGE10人真皮成纖維細(xì)胞范圍本文件適用于人真皮成纖維細(xì)胞的制備和檢測(cè)。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T2985顯微鏡GB19815離心機(jī)安全要求GB/T26497電子天平Y(jié)Y/T0588流式細(xì)胞儀JJF1665細(xì)胞技術(shù)儀校準(zhǔn)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。人真皮成纖維細(xì)胞人體皮膚組織的真皮層分離的細(xì)胞注：人真皮成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，可通過產(chǎn)生和重塑細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）參與組織修復(fù)與再生、創(chuàng)傷愈合。主細(xì)胞庫(kù)由細(xì)胞種子經(jīng)培養(yǎng)至特定倍增水平或傳代水平，并經(jīng)一次制備獲得并分裝的同質(zhì)和均一的懸液。注：細(xì)胞種子是指已通過鑒定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢測(cè)的，來(lái)源于人或動(dòng)物的，由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)以及基因工程構(gòu)建的均一細(xì)胞群體。工作細(xì)胞庫(kù)由主細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)至特定倍增水平或傳代水平，并經(jīng)一次制備獲得并分裝的同質(zhì)和均一的懸液?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。AO/PI:吖啶橙（AcridineOrange）和碘化丙錠（PropidiumIodide）CD：分化簇（ClusterofDifferentiation）COLIA1：I型膠原蛋白A1（CollagenTypeIA1）EBV：皰疹病毒（Epstein-BarrVirus）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV：人類巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus）HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR,DP,DQ：人白細(xì)胞抗原DR,DP,DQ（HumanLeukocyteAntigen-DR,DP,DQ）HTLV：人類T淋巴細(xì)胞病毒（HumanT-lymphotropicvirus）PBMCs：外周血單個(gè)核細(xì)胞（PeripheralBloodMononuclearCells）TGFβ1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TransformingGrowthFactorBeta1）TP：梅毒螺旋體（Treponemapallidum）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）Vimentin：中間絲蛋白Ⅲ型（IntermediateFilamentProteinTypeⅢ）原材料和輔料HIVHBVHCVHTLVEBVHCMVTP，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)均為陰性,應(yīng)排除有遺傳性疾病的供者，并應(yīng)對(duì)供者進(jìn)行一般情況篩查。應(yīng)建立和執(zhí)行細(xì)胞采集、運(yùn)輸、交接與儲(chǔ)存方法。細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基及其他添加物等應(yīng)建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。不宜使用動(dòng)物血清或其他動(dòng)物源成分，如必須使用，應(yīng)確認(rèn)無(wú)特定動(dòng)物源性病毒感染。細(xì)胞凍存時(shí)使用的輔料，應(yīng)建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。制備的一般要求人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)所需的基礎(chǔ)設(shè)施和環(huán)境條件，應(yīng)符合生物安全的要求，滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制需要的潔凈條件并避免微生物污染和交叉污染。制備方應(yīng)對(duì)制備操作人員進(jìn)行培訓(xùn)，建立考核標(biāo)準(zhǔn)，人員培訓(xùn)考核合格后進(jìn)行制備操作。制備方宜建立人真皮成纖維細(xì)胞的主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。人真皮成纖維細(xì)胞應(yīng)長(zhǎng)期凍存于低于-130人真皮成纖維細(xì)胞的制備應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，制備過程應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的要求。人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)或使用時(shí)，應(yīng)記錄細(xì)胞名稱，培養(yǎng)代次，細(xì)胞密度與細(xì)胞活率等信息。20技術(shù)要求人成纖維細(xì)胞應(yīng)符合表1中技術(shù)要求。表1 人成纖維細(xì)胞技術(shù)要求類別項(xiàng)目技術(shù)要求鑒別細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞應(yīng)呈梭形和/或星形，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白aCD105、CD90、Vimentin、COLIA1陽(yáng)性比例均應(yīng)≥80%CD45、HLA-DR,DP,DQ陽(yáng)性比例均應(yīng)小于5%活率細(xì)胞存活率未凍存時(shí)，人真皮成纖維細(xì)胞存活率宜≥80%凍存復(fù)蘇時(shí)，人真皮成纖維細(xì)胞存活率宜≥70%細(xì)胞功能細(xì)胞因子分泌水平（COLIA1）≥0ng/mL細(xì)胞因子分泌水平（TGFβ1）≥0ng/mL安全性無(wú)菌檢查無(wú)菌生長(zhǎng)細(xì)菌內(nèi)毒素＜3EU/mL異常毒性檢查動(dòng)物全部健存且無(wú)異常反應(yīng)，體重有增加支原體陰性成瘤性免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性染色體核型染色體核型應(yīng)為46，XY或者46，XX結(jié)構(gòu)異常≤10，超二倍體≤5，亞二倍體≤90，多倍體≤17類別項(xiàng)目技術(shù)要求a可表達(dá)不同的標(biāo)志物。檢驗(yàn)方法細(xì)胞形態(tài)體外培養(yǎng)，二維貼壁培養(yǎng)條件下，用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。細(xì)胞標(biāo)志蛋白按照附錄B細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞存活率按照附錄A細(xì)胞因子分泌水平（COLIA1）按照附錄C細(xì)胞功能指標(biāo)檢測(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞因子分泌水平（TGFβ1）按照附錄C細(xì)胞功能指標(biāo)檢測(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。無(wú)菌檢查按照中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)四部通則1101無(wú)菌檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素按照中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)異常毒性檢查按照中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)四部通則1141異常毒性檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。支原體按照中華人民共和國(guó)藥典(2020年版)四部通則3301支原體檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。成瘤性按照附錄D:人成纖維細(xì)胞成瘤性檢測(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。染色體核型（2020年版檢驗(yàn)規(guī)則抽樣方法在一個(gè)制備周期中，同一供體來(lái)源、同一制備線、同一代次、同一天收獲、同一方法制備出來(lái)的產(chǎn)品為一批。在同一批中，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目（鑒別、活率、細(xì)胞功能、安全性）1檢驗(yàn)每批次產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，并附檢驗(yàn)報(bào)告。7判定規(guī)則使用符合第5章要求的原材料和輔料、制備過程符合第6章要求，且出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目全部符合第7章的技術(shù)要求時(shí)，判為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合要求時(shí)，判為不合格品。標(biāo)簽包裝、儲(chǔ)存及運(yùn)輸包裝應(yīng)選擇對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性無(wú)影響的材料和容器。儲(chǔ)存應(yīng)選擇不影響細(xì)胞質(zhì)量性狀的細(xì)胞凍存液、細(xì)胞保護(hù)液及其他液體。應(yīng)在低于-130℃的環(huán)境下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。運(yùn)輸凍存的細(xì)胞應(yīng)在低于-130℃條件下運(yùn)輸，非凍存細(xì)胞應(yīng)在2℃～8℃條件下運(yùn)輸。細(xì)胞運(yùn)輸介質(zhì)，如細(xì)胞凍存液、細(xì)胞保護(hù)液及其他液體，應(yīng)能保證細(xì)胞活性廢棄物處理儀器和設(shè)備熒光細(xì)胞分析儀

附 錄 A（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)法熒光細(xì)胞分析儀應(yīng)按照J(rèn)JF1665要求進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)板應(yīng)使用細(xì)胞技術(shù)儀適配的細(xì)胞計(jì)數(shù)板。試劑除另有說(shuō)明外，所有試劑均為分析純，檢測(cè)用水應(yīng)為符合GB/T6682要求的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液：稱取9g氯化鈉、0.2g氯化鉀、0.24g磷酸二氫鉀或1.44g磷酸氫二鈉、1.8800mLpH值至1升。該緩沖液的pH值應(yīng)為7.2～7.4。AO/PI染液：吖啶橙和碘化丙錠染料。檢測(cè)步驟細(xì)胞懸液制備收集待檢測(cè)細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（A.22）配置細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液終濃度宜在×16個(gè)細(xì)胞/mL110個(gè)細(xì)胞/m之間。細(xì)胞染色按1：1的體積比將AO/PI染液（A.2.2）與細(xì)胞懸液（A.3.1）混合均勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)使用熒光細(xì)胞分析儀時(shí)，取混合好染料的樣品（A.3.2），上樣至計(jì)數(shù)板進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品需2個(gè)復(fù)孔檢測(cè)。在儀器面板上輸入實(shí)驗(yàn)名稱，樣品編號(hào)，選擇細(xì)胞直徑參數(shù)（12-24μm），輸入稀釋比例，讀取總細(xì)胞密度、活細(xì)胞密度和活率。計(jì)算與分析細(xì)胞胞活率“%”、活細(xì)胞濃度“個(gè)細(xì)胞/mL”以及總細(xì)胞濃度“個(gè)細(xì)胞/mL為儀器直接讀取。精密度在重復(fù)性條件下進(jìn)行兩次獨(dú)立測(cè)定，兩次測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)誤差應(yīng)不超過其算術(shù)平均值的10%。儀器和設(shè)備流式細(xì)胞儀應(yīng)符合YY/T0588要求。水平離心機(jī)應(yīng)符合GB19815要求。電子天平

附 錄 B（規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測(cè) 流式細(xì)胞法顯示分度值0.1mg，符合GB/T264977要求。試劑除另有說(shuō)明外，所有試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為符合GB/T6682要求的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液，按照A.2.2要求配制?？谷薈D90，CD105,COLIA1Vimentin，CD45,HLA-DR,DP,DQ抗體及同型對(duì)照抗體。穿膜液：可用氯化鈉注射液配制，體積比為0.5%曲拉通X-100緩沖液，或直接購(gòu)買市售穿膜液。穿膜液應(yīng)于2℃～8℃保存。10固定液：含有4%多聚甲醛的組織固定液，于2℃～8℃保存。洗滌液：磷酸鹽緩沖液，于2℃～8℃保存。樣品保存標(biāo)記后的樣品應(yīng)于2℃～8℃保存。檢測(cè)步驟樣品準(zhǔn)備收集細(xì)胞，用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液，用洗滌液清洗一遍樣品，再用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液?？贵w孵育細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體孵育min～60min。孵育結(jié)束后，用洗滌液清洗樣品兩遍，用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液。細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)志物抗體孵育樣品放入15mL1mL30min4min，棄去上清液。樣品離心管中加入1mL穿膜液，孵育30min后，用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液。樣品離心管中加入1mL30min4min，棄去上清液。選擇細(xì)胞標(biāo)志蛋白對(duì)應(yīng)的抗體及同型對(duì)照抗體，按照說(shuō)明書稀釋抗體，抗體與細(xì)胞懸液混勻后，于2℃～8℃孵育30min～60min。孵育結(jié)束后，用洗滌液清洗兩遍，用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液。過濾上機(jī)用洗滌液重懸細(xì)胞，通過孔徑為40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，使用流式細(xì)胞儀（B.1.1）上機(jī)檢測(cè)。圈門設(shè)定1B.1。12，排除沒有被熒光抗體B.1C。圖B.1圈門示意圖同型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照。B.4.4.2儀器和設(shè)備

附 錄 C（規(guī)范性）細(xì)胞功能指標(biāo)檢測(cè) ELISA法多功能酶標(biāo)儀，應(yīng)可以進(jìn)行試劑盒推薦的波長(zhǎng)檢測(cè)試劑COLIA1檢測(cè)試劑盒和TGFβ1檢測(cè)試劑盒。樣品保存實(shí)驗(yàn)組為培養(yǎng)成纖維細(xì)胞3天的培養(yǎng)上清液，保存于2℃～8℃。對(duì)照組為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，保存于2℃～8℃。檢測(cè)步驟樣品準(zhǔn)備收集5mL培養(yǎng)成纖維細(xì)胞3天的培養(yǎng)上清液，放入離心管中，用水平離心機(jī)（B.1.2）300×g，離心4min，取上清液，保存于2℃～8℃。樣品檢測(cè)按試劑盒操作說(shuō)明將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至推薦的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用濃度，樣品稀釋至推薦比例。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入試劑盒中的檢測(cè)板內(nèi)并孵育一抗。一抗孵育完成后清洗檢測(cè)板，去除殘留洗滌液。孵育帶標(biāo)簽的二抗。孵育完成后清洗檢測(cè)板，去除殘留洗滌液。檢測(cè)板內(nèi)加入顯色劑，充分反應(yīng)。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明中推薦檢測(cè)波長(zhǎng)，使用多功能酶標(biāo)儀(C.1)進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算判斷標(biāo)準(zhǔn)COLA1COLA10ngmLCOLIA1。（TGβ1：當(dāng)TGF10ng/LTGFβ1（與正文中參數(shù)對(duì)應(yīng)）儀器和設(shè)備熒光細(xì)胞分析儀

附 錄 D（規(guī)范性）人成纖維細(xì)胞成瘤性檢測(cè) 裸鼠皮下接種法熒光細(xì)胞分析儀應(yīng)按照J(rèn)JF1665要求進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)板應(yīng)使用細(xì)胞技術(shù)儀適配的細(xì)胞計(jì)數(shù)板。水平離心機(jī)應(yīng)符合GB19815標(biāo)準(zhǔn)要求。試劑除另有說(shuō)明外，所有試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為符合GB/T6682要求的一級(jí)水。磷酸鹽緩沖液：按照A.2.2配制，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。消化酶。AO/PI染液：吖啶橙和碘化丙錠染料。檢測(cè)步驟細(xì)胞消化人真皮成纖維細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，匯合度達(dá)到80%以上時(shí)，用消化酶消化，用水平離心機(jī)（D.1.3）300×g，離心4min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)按A.3.3進(jìn)行，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板（D.1.2）及熒光細(xì)胞分析儀（D.1.1）計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度，根據(jù)計(jì)數(shù)濃度，調(diào)整細(xì)胞密度至5×107個(gè)細(xì)胞/mL。細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組：將1×107個(gè)人真皮成纖維細(xì)胞活細(xì)胞，注射到6至8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，空白對(duì)照組不做處理，陽(yáng)性對(duì)照組：人腫瘤細(xì)胞系，按照腫瘤細(xì)胞系接種要求的數(shù)量注射，為