（高清版）DB51∕T 1549-2012 櫻桃致死黃化病PCR檢驗(yàn)鑒定方法

DB51DB51/T1549—2012櫻桃致死黃化病PCR檢驗(yàn)鑒定方法2012-12-20發(fā)布2013-03-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 1范圍 1 13試劑和材料 14儀器及用具 25田間取樣 26實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) 37結(jié)果判定與記錄 48樣品處理 4附錄A(資料性附錄)櫻桃致死黃化病基本信息 5本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則進(jìn)行編寫(xiě)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專(zhuān)利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：萬(wàn)佳、寧紅、謝成倫、蔣輝、吳志平、郭迪金、陳素清、余堅(jiān)志、肖連康、朱本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布。1櫻桃致死黃化病(CherryLethalYellowsphytoplasma,CLYphytoplasma)是由植原體侵染引起黃化組(16SrV),PCR方法是檢測(cè)該植原體的有效方法之一，可以快速進(jìn)行櫻桃致死黃化病檢驗(yàn)鑒定。除非另有說(shuō)明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純——滅菌超純水(ddH?O)。—研磨液(Grindingbuffer)4.1gKH?PO?,21.7gK?HPO?,10——Tris液[1M](Tris-HClbuffer)稱(chēng)取12.14gTris試劑，加蒸餾水1L攪拌至溶解，高壓滅菌—EDTA液[1M](EDTAsolution)稱(chēng)取37.224gEDTA試劑，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，邊攪拌邊加入NaOH,調(diào)pH值至8.0,加熱溶解至澄清，定容1L后高壓滅菌保存。——SDS液[10%](SDSsolution)稱(chēng)取20gSDS粉末，加蒸餾水200ml在68℃溶解。DNA提取液(DNAextrationbuffer)取Tris液10ml,EDTA液40ml,SDS液10ml,加熱攪拌至70℃混合均勻，調(diào)pH=8.0,高壓滅菌后室溫保存?！鞍酌窴液[10μg/μl](ProteinaseK-Solution)稱(chēng)取5mg蛋白酶K,加入500μl無(wú)菌超純水——十二烷基肌氨酸鈉[10%](N-Lauroylsarcosinesodiumsalt)稱(chēng)取1g十二烷基肌氨酸鈉，加入——異丙醇(C?H?O)?！猅E緩沖液(TEbuffer)1MTris-HClBuffer5ml,1MEDTA2ml,將溶液定容到500ml后，——NaCI[5M]稱(chēng)取292.5gNaCl,溶解并定容至1L?！狢TAB/NaCl溶液(CTAB/NaClbuffer)4.1gNaCl溶于80ml水中，緩慢加入10gCTAB,加2——苯酚(C?H?O)?！确?CHCl?)。——乙醇(C?H?OH)。—PCR混合緩沖液(PCRMixbuffer)含dNTPs、Mg2+、DNA聚合——植原體通用引物(Primers)。利用已報(bào)道的植原體16SrDNA和16S-23SrDNA間隔區(qū)序列R16mF2:5'-CATGCAAGTCGAACR16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATC-3'。——電泳緩沖液TAE(TAEBuffer)。在1L水中加入Tris堿242g,冰醋酸57.1ml和37.2gNa?EDTA·2H?O,pH8.5,配置成50倍貯存液；使用時(shí)稀釋為1倍工作液?！傊悄z[2%](Agarosegel)。在TAE溶液中加入2%瓊脂糖，融化后在每100ml瓊脂糖中加入5μlDNA熒光染料(GV),冷卻至60℃到入相應(yīng)制膠槽中，插入梳子，冷卻凝固備4儀器及用具——電子天平(1/100g,1/10000g)?！欣?內(nèi)徑60mm～80mm)?！埔浩?2μl~10μl、10μl~50μl、10μl~200μl、200μl~1000μl和1μl~5μl)?！酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)儀(PCR儀)。(平方米)5個(gè)樣品10個(gè)樣品20個(gè)樣品25個(gè)樣品注：不同品種面積及采樣數(shù)量分別計(jì)算，每20張葉片為1個(gè)3——稱(chēng)取1g剪碎并混合均勻的葉片，加適量液氮充分研磨后，加入1ml研磨液rpm離心15分鐘?！獥壣锨?，加入500μl的DNA提取液，20μl蛋白酶K,80μl10溫浴1-2小時(shí)后，在4℃下6000rpm離心10分鐘。——取上清，加入400μl的異丙醇顛倒混勻，-20℃保持30分鐘后，在4℃下12000rpm離心15浴30分鐘~60分鐘?！尤?00μl5MNaCl混勻后，加入84μlCTAB/NaCl,在65℃下溫浴10分鐘?！尤氲润w積的氯仿/異戊醇，12000rpm離心5分鐘，取上清；再加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，12000rpm離心5分鐘?！∩锨澹尤?倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA,4℃下13000rpm離心15分鐘?！獥壣锨澹尤?00μl70%乙醇洗滌，4℃下13000rpm離心10分鐘?！獥壣锨?，真空干燥DNA,加適量的TE懸浮，4℃下保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增需設(shè)陰性對(duì)照(模板為雙蒸水)和陽(yáng)性對(duì)照(模板為已知感染櫻桃致死黃化病植株的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸60秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8分鐘。將PCR產(chǎn)物8μl與樣品緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，同時(shí)設(shè)DNAladder作為片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。100伏電壓電泳30分鐘。4將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)觀察窗內(nèi)，觀察分析并成像保存。有該特異性條帶；供試樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同大小的1432bp特異性條帶，樣品為陽(yáng)性，判定為帶櫻桃致死黃化病植原體；供試樣品未出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同大小的1432bp特異性條帶，樣品為陰性，判定5(資料性附錄)櫻桃致死黃化病基本信息A.1分類(lèi)地位櫻桃致死黃化病植原體隸屬于細(xì)菌界(Bacteria),硬壁菌門(mén)(Firmicutes),柔膜菌綱(Mollicutes)(又稱(chēng)軟球菌綱),非固醇菌原體目(Acholeplasmatales),非固醇菌原體科(Acholeplasmataceae),植原體候選屬，16SrV組(榆樹(shù)黃化組)。A.2病原特征該植原體無(wú)細(xì)胞壁，約8nm~100nm,能夠通過(guò)細(xì)菌濾器，多型性，有球形、橢圓形、長(zhǎng)桿形、梭形、帶狀和多態(tài)不規(guī)則形等。A.3典型癥狀該病危害嚴(yán)重，寄主感病后幾年時(shí)間內(nèi)死亡率可高達(dá)100%。侵染后1~2年，主要表現(xiàn)在晚春葉片黃化，秋天落葉提早、開(kāi)花推遲，新梢葉片卷曲、皺縮、葉肉變厚，果實(shí)小