LC-MS、MS法對血栓通注射液中皂苷成分快速定量分析

\o"分享到微博"\o"分享到微信"\o"分享到QQ"\o"分享到QQ空間"【摘要】目的：建立LC-MS/MS方法快速測定血栓通注射液中5種皂苷成分。方法：色譜柱為BEHC18（2.1mm*100mm，1.8μm），流速為0.400mL/min，流動相為乙腈-水，洗脫方式為梯度洗脫，柱溫為30℃，進樣量為2μL；采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下負離子掃描方式，離子源為ESI-。結(jié)果：人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd及三七皂苷R1在濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2>0.999，定量限在0.34～1.45ng/mL；低、中、高3種濃度水平加樣回收率在90.59%～104.10%，相對標準偏差為1.27%～4.29%；進樣精密度為1.80%～2.64%。結(jié)論：本研究成功建立血栓通注射液中5種皂苷成分LC-MS/MS定量分析方法，方法操作簡單，準確度和精密度良好，并完成不同廠家不同批次血栓通注射液中5種皂苷成分測定?！娟P(guān)鍵詞】LC-MS/MS；血栓通注射液；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；人參皂苷Re；人參皂苷Rd；三七皂苷R1LC-MS/MSmethodforrapidquantitativeanalysisofsaponincomponentsinXueshuantonginjectionZHANGXiaojun1，F(xiàn)UHuihui21.GuangdongLeiyunshangPharmaceuticalCo.，Ltd，Yunfu，Guangdong527300，China；2.YunfuTraditionalChineseMedicineHospital，Yunfu，Guangdong527300，China【Abstract】Objective：ToestablishaLC-MS/MSmethodforrapiddeterminationoffivesaponincomponentsinXueshuantonginjection.Methods：ThechromatographiccolumnwasBEHC18（2.1mm*100mm，1.8μm），withaflowrateof0.400mL/min，themobilephasewasacetonitrilewater，theelutionmethodwasgradientelution，thecolumntemperaturewas30℃，andtheinjectionvolumewas2μL；Adoptingthenegativeionscanningmethodundermultiplereactionmonitoringmode（MRM），andtheionsourcewasESI-.Results：ThelinearrelationshipbetweenginsenosideRg1，ginsenosideRb1，ginsenosideRe，ginsenosideRd，andnotoginsenosideR1wasgoodwithintheconcentrationrange，withR2>0.999，andthequantificationlimitsofthefivesaponincomponentswerefrom0.34to1.45ng/mL；Therecoveryratesofthefivesaponincomponentsatlow，medium，andhighconcentrationlevelsrangedfrom90.59%to104.10%，andtherelativestandarddeviationwasfrom1.27%to4.29%；Theprecisionofinjectionwerebetween1.80%and2.64%.Conclusion：ThisstudysuccessfullyestablishedaLC-MS/MSquantitativeanalysismethodforfivesaponincomponentsinXueshuantonginjection.Themethodissimpletooperate，withgoodaccuracyandprecision，andhasbeenusedtodeterminethefivesaponincomponentsindifferentbatchesofXueshuantonginjectionfromdifferentmanufacturers.【KeyWords】LC-MS/MS；Xueshuantonginjection；GinsenosideRg1；GinsenosideRb1；GinsenosideRe；GinsenosideRd；NotoginsenosideR1血栓通注射液是以三七總皂苷為主要成分的中藥注射液[1-2]。目前，血栓通注射劑主要成分采用是HPLC法檢測[3]，此方法檢測技術(shù)簡單，但分析時間較長，常規(guī)檢測分析效率低。LC-MS/MS為藥物分析領(lǐng)域的先進檢測技術(shù)，具有專屬性強、靈敏度高、檢測時間短等特點[4]。本文成功建立了一種高效率、高靈敏度的血栓通注射液中5種皂苷成分LC-MS/MS測定方法。1儀器與試藥1.1儀器與試劑WatersTQ/S高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters），百萬分之一電子天平（上海梅特勒），乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為純凈水（娃哈哈股份有限公司）。1.2材料人參皂苷Rg1（批號：110703-201913）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202021）、人參皂苷Re（批號：110754-202125）、人參皂苷Rd（批號：110704-202124）、三七皂苷R1（批號：110745-201918），上述對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。6批血栓通注射液收集于當?shù)蒯t(yī)院藥房，其中S1～3、S4～6分別為廠家A、廠家B。2方法2.1分析方法2.1.1色譜條件色譜柱：BEHC18（2.1mm*100mm，1.8μm），流速為0.400mL/min，以乙腈為流動相A，以水溶液為流動相B，洗脫程序見表1；柱溫：30℃，進樣量：1μL。2.1.2質(zhì)譜條件離子源為電噴霧（ESI），負離子掃描模式，質(zhì)譜監(jiān)測采用多重反應(yīng)（MRM）監(jiān)測模式，毛細管電壓2.50kV，錐孔電壓30.00V，離子源溫度150℃，去溶劑溫度550℃，錐孔氣150L/Hr，去溶劑氣900L/Hr，碰撞氣0.14mL/min，氣簾氣138kPa，碰撞氣48kPa。質(zhì)譜參數(shù)見表2。2.2對照品溶液制備分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd和三七皂苷R1對照品適量，加甲醇，制成濃度為100μg/mL單標對照品貯備溶液。分別精密量取各皂苷單標對照品貯備溶液適量，用甲醇稀釋制成濃度為5μg/mL混合對照品貯備溶液。2.3供試品溶液制備取樣品適量，加甲醇溶解，定容，取續(xù)濾液即得。2.4方法學(xué)驗證2.4.1線性和定量限采用逐級稀釋法用甲醇制備標示濃度分別為5000、2500、1250、625、250、125及62.5ng/mL混合對照品溶液。每個樣品進樣1次，記錄對應(yīng)峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算R2值。采用逐級稀釋法用甲醇稀釋混合對照品溶液，以信噪比為10皂苷成分濃度為定量限。2.4.2重復(fù)性和準確度取樣品溶液適量，制備1/2平均含量水平溶液，添加混合對照品溶液，制備含量水平達70%、100%及130%水平的供試品溶液，每個濃度平行制備6份，測定1/2平均含量水平溶液2份，以標準曲線法計算各成分含量，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。2.4.3精密度取625ng/mL混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算進樣精密度。2.5樣品測定按2.3項下方法制備供試品溶液，在2.1分析方法下依法測定，計算待測成分含量。3結(jié)果3.1線性和定量限LC-MS/MS法測定血栓通注射液中5種皂苷成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表3?？梢?，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd和三七皂苷R1線性關(guān)系良好，R2>0.999，定量限在0.34～1.45ng/mL。3.2重復(fù)性、準確度和精密度血栓通注射液中5種皂苷成分重復(fù)性、準確度和精密度具體參見表4，其中5種皂苷成分低、中、高3種濃度的加樣回收率范圍為90.59%～104.10%，表明該測定方法準確度良好，且5種皂苷成分3種濃度水平測試的RSD為1.27%～4.29%，表明方法重復(fù)性良好。精密度測定結(jié)果表明，5種皂苷成分峰面積的RSD為1.80%～2.64%，說明該方法精密度良好。3.3樣品測定結(jié)果采用建立方法測定市面上的6批血栓通注射液皂苷成分的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，五種皂苷成分的含量測定差異跨度不大，不同廠家不同批次血栓通注射液生產(chǎn)工藝成熟穩(wěn)定。4討論本研究分別將五種皂苷成分的單標對照品貯備溶液直接注入質(zhì)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種皂苷成分在負離子模式下離子信息豐富，離子豐度較大，故選用負離子掃描方式。LC-MS/MS將采用不同分離原理的色譜分離與質(zhì)譜分離相結(jié)合，實現(xiàn)物質(zhì)的定量分析[5]。本研究中人參皂苷Re、人參皂苷Rd屬于同分異構(gòu)體，質(zhì)譜裂解碎片完全一致，不能單獨依靠質(zhì)譜的碎片信息實現(xiàn)分離，需采用色譜分離和質(zhì)譜檢測聯(lián)合方式。色譜分離條件摸索過程中，選用不同色譜柱對5種皂苷成分