重組DNA技術(shù)的基本工具（原卷版）-高二生物寒假復(fù)習(xí)（人教版選擇性必修3）

第07講重組DNA技術(shù)的基本工具

目標(biāo)】

1.闡明重組DNA技術(shù)所需的三種工具的作用。

2.提升對(duì)基因工程的理解能力，能夠合理分析在基因水平產(chǎn)生的問題。

3.了解進(jìn)行DNA的粗提取和鑒定的原理，進(jìn)行DNA的粗提取和鑒定的操作。

3.認(rèn)同基因工程的作用及意義，認(rèn)識(shí)到生物技術(shù)的發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。

4n

、【基礎(chǔ)知識(shí)】

工程的概念

項(xiàng)目具體內(nèi)容

操作對(duì)象基因

原理基因重組

操作環(huán)境體外

操作水平分子水平

結(jié)果獲得人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品

優(yōu)點(diǎn)克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙;定向改造生物的性狀

二、限制性核酸內(nèi)切酶

（1）來源：主要從原核生物中分離出來。

（2）種類：約4000種

（3）作用:識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核昔酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核昔酸之間的磷

酸二酯鍵斷開。

（4）限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度最常見的為6個(gè)核甘酸，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)、或其他數(shù)

量的核昔酸組成。

①在中軸線兩側(cè)切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能識(shí)別GAATTC序列，為6個(gè)核甘酸，并在G和

A之間切開。

在中軸線兩側(cè)切割，形成黏性末端它?1之間堿基正好互補(bǔ)配對(duì)，因此稱這些片斷為物吐端.

②在中軸線處切割，形成平末端。如：Smal限制酶能識(shí)別CCCGGG序列，為6個(gè)核甘酸，并在G和C之

間切開。

中軸線

平末端

限制陶從識(shí)別序列的中心軸線處切開

在中軸線處切割,形成平末端

時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是

平整的，這樣的切II叫V末端-。

總結(jié)歸納

1.限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別并附著特定的核昔酸序列，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核甘酸之

間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。

2.限制作用實(shí)際就是限制酶降解外源DNA,維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。一般不切割自身的DNA分子，

是由于甲基化的修飾作用，可使腺喋玲A和胞嚏咤C甲基化而受到保護(hù)，通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺

傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。

3.根據(jù)酶的功能特性、大小及反應(yīng)時(shí)所需的輔助因子，限制性內(nèi)切酶可分為兩大類，即I類酶和n類酶。

其中，II類酶有EcoRI、BamHLHindII、HindIII等，在所識(shí)別的特定堿基序列上有特定的酶切位點(diǎn)，因

而DNA分子經(jīng)過II類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進(jìn)行分離、鑒別。

4.限制酶識(shí)別DNA序列中的回文序列。回文序列指的是雙鏈DNA或RNA分子中的特定的核甘酸片段，該

片段在其中一條鏈上按5至J3,讀取的序列與其互補(bǔ)鏈上按相同的5,到3,讀取的序列一致。例如，DNA序列

ACCTAGGT之所以是回文序列，是因?yàn)樗幕パa(bǔ)序列是TGGATCCA,而反向互補(bǔ)序列是ACCTAGGT,和

其原來序列一致。有些限制酶的切割位點(diǎn)在回文的一側(cè)（如EcoRI、BamHLHind等），因而可形成粘性

末端；另一些H類酶如Alul、BsuRLBall,HalHRHPaLSmal等，切割位點(diǎn)在回文序列中間，形成平

末端。

三、DNA連接酶

（D作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核甘酸之間的磷酸二酯鍵。即把脫氧核糖

和磷酸交替連接而構(gòu)成的DNA骨架上的缺口連接起來。

⑵類型：

例EcoliDNAiSSSST?DNA3酶

來源大腸桿菌L噬菌體

功能只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端（效率較低）

結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核甘酸之間的磷酸二酯鍵|

歸納總結(jié)

1.DNA連接酶分為兩大類:一類是利用ATP催化兩個(gè)核甘酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴ATP的DNA連

接酶；另一類是利用煙酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD+）的能量催化兩個(gè)核甘酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴

NAD+的DNA連接酶。DNA連接酶是通過催化形成磷酸二酯鍵把兩條DNA（雙股或是單股DNA）黏合成

一條。

2.教材中提到的EcoliDNA連接酶，來源于大腸桿菌，可用于連接粘性末端；T4DNA連接酶，來源于T4

噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率低。E-coliDNA連接酶對(duì)胰蛋白酶敏感，可被其水解。

水解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶與NAD（而不是ATP）反應(yīng)形成酶-AMP中間物，但不能繼

續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進(jìn)磷酸二酯鍵的形成。T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條

DNA雙鏈上相鄰的5,磷酸基和3,羥基之間形成磷酸二酯鍵。

四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

（1）載體作用：將目的基因載入受體細(xì)胞。利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。

（2）載體種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等

（3）最常用載體：質(zhì)粒

大腸桿菌細(xì)胞

目的基因.

插入位點(diǎn)

氯爺青市素

抗性基閃

大腸桿菌及質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖

特點(diǎn)：

①裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。

②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)。

③在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。

④有特殊的標(biāo)記基因，如：抗生素的抗性基因（四環(huán)素抗性基因（tetr）、氨葦青霉素抗性基因（ampr）等）、熒

光蛋白基因（綠色熒光蛋白基因（GFP）、紅色熒光蛋白基因（RFP）。

⑤對(duì)細(xì)胞無毒無害。

⑥大小適中，便于提取和操作。

歸納總結(jié)

1.基因工程中常用的運(yùn)載體主要有兩類：

一類運(yùn)載體是噬菌體或某些病毒等。

另一類是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒，它是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小、獨(dú)立于擬核之外的環(huán)狀DNA,有的一個(gè)細(xì)菌中

有一個(gè)，有的一個(gè)細(xì)菌中有多個(gè)。質(zhì)粒能通過細(xì)菌間的接合由一個(gè)細(xì)菌向另一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移，可以獨(dú)立復(fù)制，

也可整合到細(xì)菌擬核DNA中，隨著擬核DNA的復(fù)制而復(fù)制。

2.質(zhì)粒作為載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的質(zhì)粒。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載

體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)

別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。

3.質(zhì)粒載體都有三個(gè)共同的特征：一個(gè)復(fù)制子、一個(gè)選擇性標(biāo)志和一個(gè)克隆位點(diǎn)。

復(fù)制子是含有DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的一段DNA,也包括表達(dá)由質(zhì)粒編碼的復(fù)制必需的RNA和蛋白質(zhì)的基因。

克隆位點(diǎn)是限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，外源性DNA可由此插入質(zhì)粒內(nèi)，而且并不影響質(zhì)粒的復(fù)制能力，或?yàn)?/p>

宿主提供選擇性表型。一般地，載體都含有多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)的存在可以確保載體合適大部分的DNA

片段，可以針對(duì)插入片段提供特定的酶切位點(diǎn)圖譜，防止插入片段插入不恰當(dāng)?shù)奈恢茫谫|(zhì)粒重組操作方

面具有更大的靈活性。

編碼抗生素抗性的基因是最普遍的細(xì)菌選擇性標(biāo)志（如pBR322）。主要的抗生素抗性基因有：氨葦青霉素

抗性基因、氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因和卡那霉素抗性基因四種。

五、DNA的粗提取和鑒定

（一）提取生物大分子的基本思路

選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。

DNA粗提取的基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA,

去除其他成分。

（二）提取DNA的基本原理

1.DNA在NaCl中的的溶解性：

在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí),

DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為

2moi/L時(shí)，DNA的溶解度最大；濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA

在鹽溶液中溶解或析出。

2.DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性

（1）對(duì)酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對(duì)DNA沒有影響。

（2）對(duì)溫度的耐受性：大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60?80°C的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。

（3）對(duì)洗滌劑的耐受性：洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)但對(duì)DNA沒有影響。

3.DNA在酒精溶液中的溶解性

DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。

（三）DNA的鑒定

沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色

saw*

歸納總結(jié)

1.實(shí)驗(yàn)材料的選取：

凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。

2.破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液

如果是動(dòng)物細(xì)胞，則破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸儲(chǔ)水，同時(shí)用玻

璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋

蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。

3.去除濾液中的雜質(zhì)：

法一：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2moi/L時(shí)，DNA的溶解度最

大；濃度為014mol/L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。

法二：是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA,從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；

法三：是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

【考點(diǎn)剖析】

考點(diǎn)一：限制性內(nèi)切酶

［例1.圖甲表示某環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRI）完全酶切后的片段電泳結(jié)果若改變

條件使其酶切不充分就有可能獲得如圖乙所示的電泳結(jié)果（Kb即千個(gè)堿基對(duì)）。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

okb

7.okb

6.5kb

4.0kb

4.工

4.Okb0kb

5kb

2.0kb

2L.

5kb

1.5kbL

S0kb

1.Okb5kb

0.5kb

甲乙

A.該DNA分子全長(zhǎng)至少為7Kb,該DNA分子中至少含有4個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)

B.反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，得到圖甲結(jié)果的可能性越大

C.限制性核酸內(nèi)切酶主要來自原核生物，化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)

D.適當(dāng)增加EcoRI濃度，更可能得到圖乙的結(jié)果

【答案】D

【解析】據(jù)題意和圖示分析可知：環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRi）完全酶切后得到4.0、1.5、

1.0和0.5四種長(zhǎng)度的DNA片段，說明該DNA分子全長(zhǎng)至少為7Kb,至少含有4個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)。反

應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)或適當(dāng)增加EcoRI濃度，DNA被切割越徹底，得到圖甲結(jié)果的可能性越大。環(huán)型DNA分子經(jīng)

限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRi）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四種長(zhǎng)度的DNA片段，說明該DNA分

子全長(zhǎng)至少為7Kb,環(huán)狀DNA分子，可以被限制性核酸內(nèi)切酶（氏oRl）完全酶切后得到至少4個(gè)DNA

片段，說明該DNA分子中至少含有4個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，故A正確；反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，DNA被切割越徹底，

得到圖甲結(jié)果的可能性越大，故B正確；限制性核酸內(nèi)切酶主要來自原核生物，限制酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白

質(zhì)，C正確；

D、適當(dāng)增加EcoRI濃度，可得到圖甲的結(jié)果，故D錯(cuò)誤。

考點(diǎn)二：DNA連接酶

2.限制酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的工具酶，限制酶通常將DNA分子切割成帶有

黏性末端的DNA片段，而DNA連接酶可縫合帶有黏性末端的DNA片段。據(jù)圖分析錯(cuò)誤的是（）

A.圖示三個(gè)黏性末端一定由兩種不同的限制酶切割產(chǎn)生

B.圖示中共有兩種黏性末端，其中甲與乙黏性末端相同

C.a點(diǎn)核甘酸之間通過磷酸二酯鍵連接，b處核昔酸之間通過氫鍵連接

D.催化甲形成的限制酶有可能不識(shí)別由甲、乙形成的重組DNA分子

【答案】A

【解析】限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核甘酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核甘酸

之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成黏性末端和平末端兩種；DNA連接酶連接的是兩個(gè)核甘酸之間的磷酸二酯鍵。

切割產(chǎn)生甲的限制酶的識(shí)別列為：GAATTC//CTTAAG,切割產(chǎn)生乙的限制酶的識(shí)別列為：

CAATTG//GTTAAC,切割產(chǎn)生丙的限制酶的識(shí)別序列為：CTTAAG//GAATTC,由此可見，甲、乙、丙的

黏性末端是由三種限制酶催化產(chǎn)生的，A錯(cuò)誤；由圖可知，甲、乙的黏性末端相同，均為AATT一,丙的黏

性末端為TTAA—,因此圖示中共有兩種黏性末端，B正確；a點(diǎn)屬于兩個(gè)核甘酸之間通過磷酸二酯鍵連接

成鏈，b點(diǎn)屬于兩條鏈之間的核甘酸，通過氫鍵相連，C正確；切割甲的限制酶的識(shí)別列為：

GAATTC//CTTAAG,而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為：GAATTG//CTTAAC,因此切割甲的限制

酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。

考點(diǎn)三、基因工程的載體

3.質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說法正確的是（

A.質(zhì)粒不僅存在于細(xì)菌中，也存在于某些病毒中B.細(xì)菌的基因只存在于質(zhì)粒上

C.質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子D.質(zhì)粒是基因工程中的重要工具酶之一

【答案】C

【解析】基因工程常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、

獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、酵母菌等生

物中，病毒中沒有質(zhì)粒，A錯(cuò)誤；細(xì)菌基因主要存在于擬核DNA上，也有少數(shù)存在于質(zhì)粒上，B錯(cuò)誤；質(zhì)

粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于細(xì)胞核外或擬核外的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，C正確；質(zhì)粒是基因工程中的重要工

具之一，但不是工具酶，基因工程中的工具酶是限制酶和DNA聚合酶，D錯(cuò)誤。

考點(diǎn)四、DNA的粗提取和鑒定

作］例4.如圖是“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖，相關(guān)敘述正確的是（)

95%酒精各加4mL:茶胺試劑

（冷卻，50mL）

圖1圖2

A.圖1中溶液a是0.14mobL1的NaCl溶液

B.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶

C.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯

D.圖2試管1的作用是證明2mol-L1NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色

【答案】C

【解析】圖1中溶液a是2moi的NaCl溶液，A錯(cuò)誤；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而

蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶，B錯(cuò)誤；圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤（試管2中未將DNA溶于2moi的

NaCl溶液中），可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯，C正確；圖2試管1的作用是證明2moiNaCl溶

液遇二苯胺不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，D錯(cuò)誤。

【真題演練】

1.（2021山東高考，13）粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸儲(chǔ)水并攪拌，過濾后所得濾液進(jìn)行

下列處理后再進(jìn)行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物的處

理方式是（）

A.加入適量的木瓜蛋白酶

B.37?40℃的水浴箱中保溫10-15分鐘

C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精

D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至21noi/LT過濾-調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L

2.（2020海南高考生物，10）下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是（）

A.羊的成熟紅細(xì)胞可作為提取DNA的材料

B.提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽

預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解

D.在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色

3.（2018?北京）用XhoI和SalI兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物分

離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是（）

XhoISai1Sal1SalIXhoI

I艇切位點(diǎn)圖

A.圖1中兩種酶識(shí)別的核甘酸序列不同

B.圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA

C.泳道①中是用Sall處理得到的酶切產(chǎn)物

D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA

4.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1）,擬將其與質(zhì)粒（圖

2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ?/p>

BamHI

&oR】/h動(dòng)子\

，終止子\

EcoR1EcoR[4啟動(dòng)子一i

潮u素\質(zhì)粒/

IC基因|抗性融因\終止子?

圖1圖2

A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒

B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞

C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞

D.用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上

5.（2021?全國(guó)乙卷高考真題）用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的

生物產(chǎn)品。在此過程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示。

IIII

GAATTCCCCGGGCTGCAGGATATC

CTTAAtGGGGtCCCGtACGTCCTAtTAG

限制酶：EcoRISmalPstIEeoRV

回答下列問題：

（1）常用的DNA連接酶有E.co〃DNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中酶切割后的DNA片

段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。

（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是o

（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受

體細(xì)胞中能;質(zhì)粒DNA分子上有,便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有

標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是o

（4）表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指。

6.（2021海南）25.CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術(shù)，Cas9基因表達(dá)的Cas9蛋白像一把“分子剪

刀”，在單鏈向?qū)NA（SgRNA）引導(dǎo)下，切割DNA雙鏈以敲除目標(biāo)基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9

基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示。

回答下列問題。

（1）過程①中，為構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，需對(duì)含有特定sgRNA編碼序列的DNA進(jìn)行酶切處理，然

后將其插入到經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上，插入時(shí)所需要的酶是。

（2）過程②中，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的方法是o

（3）過程③~⑤中，SgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體，該復(fù)合體中的SgRNA可識(shí)別并與目標(biāo)DNA序列特

異性結(jié)合，二者結(jié)合所遵循的原則是o隨后，Cas9蛋白可切割____________序列。

（4）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除一個(gè)長(zhǎng)度為1200bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成

功所采用的方法是，基因敲除成功的判斷依據(jù)是O

（5）某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人員將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒中獲得重

組質(zhì)粒，隨后將其導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構(gòu)建得到能

大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡(jiǎn)述CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)，將該蛋白酶基因插入到基因

組DNA的編輯過程：o

7.（2021遼寧，24）PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞

增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為0.9kb

（lkb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。回答下列問題：

（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA,再經(jīng)過程得到cDNA,將其作為PCR

反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來擴(kuò)增目的基因。

（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見下表。為使phb2基因（該基因序

列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入和

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用

（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。

Hindm

Pvit2

BaniUI啟動(dòng)子KpnI

氨節(jié)青毒素^EcoRI

抗性基因

PstI

制原點(diǎn)

Kpnl

圖1

相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

AJAGCTTG；AATTC

HindlllEcoRI

TTCGA^ACTTAA^G

CAGJCTGCTGCJAG

PvitllPstI

GTCTGACGAfCGTC

GJGTACCGJGATCC

KpnlBamHI

CCATGfGCCTAGfG

注：箭頭表示切割位點(diǎn)

（3）轉(zhuǎn)化前需用CaCL處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。

（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨葦青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、

4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離，結(jié)果如圖2,

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。

注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中

（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)處于細(xì)胞

周期（示意圖見圖3）不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖可能的原

因是將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的（填“Gi”或"S”或“G2/M”）期。

酸G1期幽S期口6\翔

501-

4s0-

t

PHB2

圖f

注：小G、和M

【過關(guān)檢測(cè)】

1.在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列關(guān)于限制酶的敘述錯(cuò)誤的是（）

A.限制酶主要是從原核細(xì)胞中獲取的

B.每一種限制酶只能識(shí)別特定的核甘酸序列

C.限制酶的作用位點(diǎn)是相鄰核甘酸之間的氫鍵

D.同一種限制酶切割不同的DNA分子可產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的黏性末端

2.下表為4種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)Q表示切割位點(diǎn)），下列敘述正確的是（）

限制酶1—JGATC—

限制酶2一CATGJ—

限制酶3一GJGATCC—

限制酶4一GGJCGCC—

A.在使用限制酶的同時(shí)還需要解旋酶

B.限制酶1和3切割DNA分子產(chǎn)生的黏性末端相同

C.圖中限制酶的識(shí)別序列都由4個(gè)核甘酸組成

D.限制酶4作用后產(chǎn)生的是平末端

3.以下是幾種不同限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列的敘述中，正確的是（）

①…CTGCA②…G③…TG④…G

…G■??CTIAA…AC,?,CTGCA

A.以上DNA片段是由4種限制酶切割后產(chǎn)生的

（A.ATT

QTTAA上

B.②片段是在酶切位點(diǎn)為1的限制酶作用下形成的

C.①和④兩個(gè)片段在DNA聚合酶的作用下形成的重組DNA分子

D.限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵

4.DNA連接酶是基因工程的必需工具，下列有關(guān)DNA連接酶的敘述，正確的是（）

A.DNA連接酶可以將任意的兩個(gè)DNA片段連接成一個(gè)重組DNA分子

B.DNA連接酶發(fā)揮作用時(shí)需要識(shí)別特定的脫氧核甘酸序列

C.DNA連接酶可以催化兩個(gè)脫氧核甘酸之間磷酸二酯鍵的形成

D.E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端

5.作為基因工程的運(yùn)輸工具一載體，必須具備的條件及理由對(duì)應(yīng)錯(cuò)誤的是（）

A.能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因

B.具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn),以便于目的基因的插入

C.具有某些標(biāo)記基因，以便目的基因能夠準(zhǔn)確定位與其結(jié)合

D.對(duì)宿主細(xì)胞無傷害,以免影響宿主細(xì)胞的正常生命活動(dòng)

6.[2023寧夏石嘴山高三月考]在重組DNA技術(shù)中，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，通常利用質(zhì)粒作為載體。下列關(guān)

于質(zhì)粒的敘述，正確的是（）

A.質(zhì)粒是一種只存在于原核細(xì)胞中的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的環(huán)狀DNA分子

B.質(zhì)粒的復(fù)制和表達(dá)過程遵循中心法則和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則

C.外源基因只有通過質(zhì)粒整合到受體細(xì)胞的DNA中才能表達(dá)

D.大多數(shù)天然質(zhì)粒都不需要人工改造，可以直接作為載體使用

7.下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是()

A.該實(shí)驗(yàn)不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料

B.將洋蔥研磨液置于4。。冰箱中能防止DNA被降解

C.該實(shí)驗(yàn)中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的預(yù)冷酒精可用來析出、純化DNA

D.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行沸水浴加熱

8.如圖為“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的部分操作流程。下列相關(guān)敘述正確的是()

A.將圖1中的研磨液過濾后保留沉淀

B.圖2過程，用玻璃棒進(jìn)行快速交叉攪拌會(huì)使DNA析出更快

C.圖2析出得到的白色絲狀物只能溶于2moi/L的NaCl溶液

D.圖3對(duì)提取后的DNA進(jìn)行鑒定，兩支試管中均要加入二苯胺試劑

8.下列有關(guān)基因工程工具的敘述，錯(cuò)誤的是()

A.限制性內(nèi)切核酸酶只能用于切割獲取目的基因

B.能連接黏性末端的DNA連接酶不一定能連接平末端

C.DNA連接酶縫合兩個(gè)黏性末端時(shí)有氫鍵的重新連接

D.基因工程中使用的載體有質(zhì)粒、某些動(dòng)植物病毒及噬菌體

9.現(xiàn)有一長(zhǎng)度為3000堿基對(duì)(bp)的線性DNA分子，用限制性內(nèi)切核酸酶完全酶切后，進(jìn)行凝膠電泳，使酶切產(chǎn)

物分開。用酶H單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖1;用酶B單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖。用酶H和酶B同時(shí)酶切，結(jié)果如圖3。該

DNA分子的結(jié)構(gòu)及其酶切圖譜是()

2000bp2000bp

1400bp

1000bp

600bp600bp

400bp400bp

圖1圖2圖3

BHB

Ai?_______[

40060014006006004006001400

八BHB-HBH

0。400600600'1400D.―?-----1------------1—

4006001400600

10.像Bell(一TJGATCA—)、Bg/H(—AJGATCT—)、MboI(—<GATC—)這樣,識(shí)別序列不同但能產(chǎn)生相同

的黏性末端的