胚胎干細(xì)胞的鑒定職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)課件

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)胚胎干細(xì)胞的鑒定職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)1、ES細(xì)胞生物學(xué)特性（1）ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動(dòng)物個(gè)體。

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（2）ES細(xì)胞生長(zhǎng)特性ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥(niǎo)巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時(shí)可見(jiàn)單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。

ES細(xì)胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次。此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來(lái)自一個(gè)克隆的細(xì)胞具有同樣的特征。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（3）ES細(xì)胞的高度分化潛能ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)中：“簡(jiǎn)單類胚體”

“囊狀胚體”

細(xì)胞分化物。ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化

*用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，

*聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞。

*將ES細(xì)胞注射到同源動(dòng)物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞組成可代表3個(gè)胚層細(xì)胞。

*用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動(dòng)物個(gè)體。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（4）堿性磷酸酶的表達(dá)

許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達(dá)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽(yáng)性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽(yáng)性。因此，AKP常用來(lái)作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（5）胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)

早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測(cè)到SSEA-1的表達(dá)。小鼠SSEA-1的表達(dá)自8細(xì)胞期開(kāi)始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強(qiáng)陽(yáng)性，晚期囊胚中部分ICM呈強(qiáng)陽(yáng)性，部分呈弱陽(yáng)性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)2、ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面：

①形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動(dòng)物皮下可形成畸胎瘤，包括三個(gè)胚層細(xì)胞；

②形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，它是一個(gè)與畸胎瘤相似的多種細(xì)胞系混雜的集合體、具有三個(gè)胚層組織；

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③直系分化。通過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞；

④形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)3、ES細(xì)胞的鑒定--細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)--核型分析--堿性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫熒光標(biāo)記--分化能力檢測(cè)體外分化試驗(yàn)體內(nèi)分化試驗(yàn)嵌合體形成試驗(yàn)核移植試驗(yàn)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（1）ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定依ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個(gè)或幾個(gè)核仁）和生長(zhǎng)特性（呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密聚集，形似鳥(niǎo)巢，界限不清）對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（2）核型分析

ES細(xì)胞具有正常二倍體核型，可用核型分析進(jìn)行檢驗(yàn)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)

（3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚鈉水解，產(chǎn)生α-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性染料而呈現(xiàn)顏色。步驟：生長(zhǎng)胚胎干細(xì)胞克隆的蓋片以無(wú)水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室溫5-10min→水洗10min→復(fù)染（甲基綠等）10min。結(jié)果：未分化胚胎干細(xì)胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復(fù)染液顏色。對(duì)照：以已建系ES細(xì)胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽(yáng)性對(duì)照，作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對(duì)照。

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)免疫熒光檢測(cè)SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性Gearhart分離的hES陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性小鼠ES陽(yáng)性陰性陰性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原有種屬差異。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)

Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表達(dá)。人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，其表達(dá)能力大大降低。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)（5）分化能力檢測(cè)體外分化能力觀察:無(wú)飼養(yǎng)層和無(wú)抑制分化因子的條件下培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞會(huì)分化成各種細(xì)胞或發(fā)育成胚胎體：3d“簡(jiǎn)單類胚體”

5-10d“囊狀胚體”

貼壁細(xì)胞為細(xì)胞分化物。職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)體內(nèi)分化能力觀察：ES細(xì)胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個(gè)細(xì)胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個(gè)細(xì)胞）→約2周后出現(xiàn)腫塊，4-5周進(jìn)一步增大，摘除腫塊→固定切片染色：見(jiàn)三個(gè)胚層組織，為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細(xì)胞和組織的移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤職業(yè)教育醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫(kù)嵌合能力測(cè)定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內(nèi)，或?qū)?lái)源于白化體小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi)，再移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體。如