園藝植物遺傳育種 課件 第八章 誘變育種

園藝植物遺傳育種第一章

緒論第二章經(jīng)典遺傳與細胞質遺傳第三章數(shù)量遺傳第四章園藝植物種質資源與引種馴化第五章選擇育種第六章有性雜交育種第七章雜種優(yōu)勢利用第八章誘變育種第九章現(xiàn)代生物技術育種第十章新品種的審定與推廣繁育實訓1-15第八章誘變育種8.1誘變育種的概念和意義

8.1.1概念和發(fā)展概況8.1.2意義

8.2誘變育種的遺傳基礎

8.2.1染色體數(shù)目的改變8.2.2染色體結構的改變8.2.3基因突變和表觀遺傳變異8.3輻射育種

8.3.1輻射誘變源的種類及特性8.3.2輻射誘變的作用機制8.3.3輻射誘變的方法8.3.4輻射育種程序8.4化學誘變育種

8.4.1化學誘變的特點8.4.2化學誘變劑的種類、特性和誘變機制8.4.3化學誘變的方法8.5多倍體育種

8.5.1多倍體的特點8.5.2人工獲得多倍體的方法8.6航天與離子注入誘變育種

8.6.1航天育種8.6.2離子注入誘變育種

練習與思考

本章小結知識目標●了解誘變育種的地位和特點●了解航天和離子注入誘變育種的概況●理解誘變育種的概念●理解染色體數(shù)目和結構變異、基因突變和表觀遺傳變異的相關知識●理解物理誘變與化學誘變的不同特點●掌握利用物理和化學等誘變育種的技術能力目標●能分析染色體變異的遺傳學效應●能開展物理和化學誘變育種8.1誘變育種的概念和意義誘變育種（mutationbreeding），又稱引變育種或突變育種，是人為利用物理和化學等因素誘發(fā)作物產生遺傳變異，在短時間內獲得有利用價值的突變體，根據(jù)育種目標要求，對突變體進行選擇和鑒定，直接或間接地培育出新品種的育種途徑。8.1.1概念和發(fā)展概況

1927年，MullerHJ和StadlerＬＪ幾乎同時采用Ｘ線，分別誘發(fā)果蠅和玉米突變成功；1937年，BlakesleeAF等利用秋水仙堿誘導植物多倍體獲得成功。通過這些試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘變的后代突變的頻率比自然突變大得多，從而開創(chuàng)了物理和化學的誘變育種工作。到20世紀50年代，由于原子技術廣泛應用，采用輻射育種比化學誘變育種更為普遍。近幾十年來，通過誘變在果樹、蔬菜、園林等植物中都獲得了許多有利的突變體，并進一步培育成為新品種。據(jù)不完全統(tǒng)計，1966—1995年的30年中，我國通過誘變育成的作物品種總數(shù)為459個，其中園藝植物品種數(shù)為89個，占19.4％。隨著技術研究的深入，誘變育種在創(chuàng)造園藝植物新品種中將顯示出更大的潛力。特別是隨著近年來我國在航天和重離子注入誘變育種領域所取得的開創(chuàng)性成績，相信誘變育種的前景將更加廣闊。誘變育種在下述各方面顯示出突出的作用地位。（１）提高突變頻率、擴大“變異譜”、創(chuàng)造新類型利用輻射誘發(fā)突變，變異頻率較自然突變可提高100～1000倍，而且變異的類型多、范圍廣。植物的高突變頻率和廣泛的遺傳變異，為選擇提供了豐富的材料。若將誘變材料進行組織培養(yǎng)，有可能大大提高誘變頻率和擴大“變異譜”。8.1.2意義花卉植物的觀賞性狀是多方面的，有觀花的、觀葉的和觀果的等，而且對觀賞性狀在不同時期有不同的要求，因此不論在葉形、花型、花色、株型等方面的突變都能構成觀賞效果?；ɑ懿幌窆麡?、蔬菜要獲得綜合性狀好的果實或產品器官，因此對其采取誘變育種更容易收到效果。有些無性繁殖的園藝植物常是不育的三倍體或進行單性生殖，不能采用常規(guī)方法獲得雜交種子，而利用輻射誘變方法處理植株的無性器官，可在營養(yǎng)生長階段直接發(fā)現(xiàn)、選擇突變，這就為該類植物選育新品種提供了可能性。（２）適于改良品種的個別性狀在現(xiàn)有許多園藝植物良種中，還有某些性狀不符合現(xiàn)代化品種要求。為改進個別不良性狀，如采用雜交和選擇等常規(guī)育種方法，由于基因的分離和重組，往往會引起原有優(yōu)良性狀組合解體；有時則可能由于某些有利基因與不利基因是連鎖的，造成這些有利基因控制的性狀得到改良，而相應的一些不良性狀無法得到改良。由于誘變處理易于誘發(fā)點突變（pointmutation），如果應用誘變處理，則可能打破二者之間的連鎖，或者發(fā)生個別基因的突變，經(jīng)過分離選擇，有可能獲得只改造原品種個別缺點而不損傷其他優(yōu)良性狀的突變體。在無性繁殖植物上誘變育種效果明顯。許多園藝植物雖也可以采用有性繁殖，但它們常是高度雜合的，且多數(shù)是多倍體或非整倍體，因此通過雜交或種子繁殖，后代差異性極大，要在它的實生苗后代中選擇只有某些性狀得到改良而又保持原品種其他優(yōu)良特性不變的個體是很困難的。所以，這類植物的品種改良常依賴于選擇自然發(fā)生的芽變。采用輻射誘變的方法，特別是對觀賞植物，可以達到保持其他性狀不變而只改良某一、兩個性狀的效果，如在原花色、花型的基礎上誘變使某些性狀發(fā)生改變，就可獲得一系列的花色、花型的突變體，使其更有觀賞價值。（３）誘變處理比較簡單，可縮短育種年限通常應用實生選種、雜交育種等方法獲得種子后，從種子播種到開花結果需要經(jīng)過較長期的培育、選擇和鑒定。以木本園藝植物最為明顯。其童期長，雜合度高，利用常規(guī)雜交育種方法，既費時間，又難以預測其結果，而誘變育種則可大大加速育種進程。因此，對于無性繁殖的果樹和部分花卉植物，誘變育種顯得特別有利。當誘發(fā)出現(xiàn)某些優(yōu)良性狀（如無核果實）時，即可進行嫁接繁殖，可以早結果、早鑒定，并能把優(yōu)良的突變迅速固定下來。例如，果樹采用有性雜交方法選育一個新品種需要長達20～30年的時間，而用輻射誘變方法僅需10年左右。此外，輻射材料（外照射）不帶有放射性物質，處理方法也比較簡便，有利于推廣普及應用。（４）變異方向和性質不易控制由于對誘變機制方面知之甚少，誘變后代多數(shù)是劣變，有利突變只有少數(shù)，變異方向和性質很難進行有效預測和控制。因此，如何提高突變頻率、定向改良品種性狀、創(chuàng)造新的優(yōu)良品種，還需要進行大量的深入研究。（５）與其他育種方法結合使用，將發(fā)揮其巨大的作用①與雜交育種結合誘發(fā)突變獲得的突變體具有所需要的性狀，可通過選擇和雜交等手段轉移到另一個品種上，或將某個品種的優(yōu)良性狀轉移給突變體，或通過突變體之間彼此雜交，有可能創(chuàng)造更優(yōu)異的新品種。②與遠緣雜交結合遠緣雜交中可應用誘變因素來處理花粉，以克服遠緣雜交的不親和性，促進雜交結實，使遠緣雜交獲得成功。③與離體培養(yǎng)結合植物的組織、花粉和原生質體通過離體培養(yǎng)再生植株，離體培養(yǎng)過程中可發(fā)生變異，也可通過人工誘變的方法處理植物的組織和細胞，使培養(yǎng)物發(fā)生變異，這在品種遺傳改良上更具獨特的優(yōu)點。首先，是在極小的空間內處理許多均一的單細胞；其次，是單細胞的突變不會受到相鄰細胞的掩蔽，不會產生嵌合體；再次，利用適當?shù)募夹g和選擇劑，容易將突變細胞從大量混合細胞群中有效地篩選出來。除了單細胞（或原生質體）外，多細胞的愈傷組織等也可用于誘變處理。由于愈傷組織最終可分化出許多植株，因此，愈傷組織誘變處理后形成的突變細胞就有可能最終形成生殖細胞，并通過有性世代遺傳給子代，從而增加離體培養(yǎng)再生植株后代的遺傳變異，創(chuàng)造更多變異選擇的機會。8.2誘變育種的遺傳基礎許多無性繁殖的植物容易用營養(yǎng)器官如葉、花梗、球莖塊、鱗莖片等進行離體培養(yǎng)，也容易產生不定芽，因此為輻射誘變與離體培養(yǎng)技術的結合應用提供了更多的可能性。這樣就可以通過組織培養(yǎng)的實驗室操作，在較短的時間內分離體細胞突變，并在較小的空間內進行組織培養(yǎng)，使其栽入田間后能較快地選育出人們需要的新品種。誘變育種是人為地利用物理和化學等因素誘發(fā)植物產生遺傳變異（染色體改變和基因突變）的結果。它以染色體改變或基因突變?yōu)榛A，因此有必要先了解染色體改變和基因突變等問題。染色體的改變包括兩大類型，一是染色體數(shù)目的改變，二是染色體結構的改變。無論是哪一種改變，都會影響生物體的遺傳性狀。每種生物的染色體數(shù)目是恒定的。觀察二倍體細胞時，銀杏有24條染色體，配成12對；洋蔥有16條染色體，配成８對；杜鵑花有26條染色體，配成13對。如果用n表示單倍體細胞中一套染色體的數(shù)目，則銀杏n＝12，２n＝24；洋蔥n＝８，２n＝16；杜鵑花n＝13，２n＝26（表8.2.1８）。染色體數(shù)目的改變可分為整倍體（euploid）的改變和非整倍體（aneuploid

）的改變。8.2.1染色體數(shù)目的改變整倍體整倍體是指染色體數(shù)目是單倍體數(shù)目的整倍數(shù)。例如，四倍體的染色體數(shù)目是單倍體的４倍，如n＝８，則４n＝32。凡是染色體數(shù)目是單倍體數(shù)目３倍以上的統(tǒng)稱為多倍體（polyploid）。大多數(shù)真核生物的體細胞是二倍體（diploid），配子是單倍體（haploid）。但多倍體高等植物配子的染色體數(shù)目就不止是１套。例如，六倍體普通小麥的配子中染色體是３套基本染色體組。此時，一套基本染色體組稱為１X，n＝３X，２n＝６X。具有３個以上的相同染色體組的細胞或個體稱為同源多倍體（autopolyploid）。多倍體細胞里的染色體組來自不同的親本，稱為異源多倍體（allopolyploid）。這些概念都可應用于育種。例如，我國遺傳學家鮑文奎從普通小麥同黑麥（Secale

cereale）雜交得到的異源八倍體小黑麥（Triticale）中選育出一些品種，具有抗逆能力強、穗大、子粒蛋白質含量高、生長優(yōu)勢強等優(yōu)良性狀。非整倍體非整倍體是指整倍體染色體中缺少或額外增加１條或若干條染色體，一般是在減數(shù)分裂時一對同源染色體不分離或提前分離而形成n－１或n＋１的配子。這類配子彼此結合或同正常配子（n）結合，產生各種非整倍體細胞。正常的２n個體又可稱為雙體（disome），即在減數(shù)分裂時，所有染色體都能兩兩配對。雙體包括二倍體和偶數(shù)異源多倍體。雙體中缺少１對同源染色體，稱為缺體（nullisomic），即２n－２；雙體中缺了１條染色體，使某１對同源染色體只剩１條，稱為單體（monosomic）即２n－１；如果雙體中缺了２條非同源染色體，成為２n-１-１，稱為雙單體；如雙體中多了１條染色體，使某一對同源染色體變成３條，就稱三體（trisomic），即２n＋１；雙體中某一對同源染色體變成４條同源染色體，稱為四體（tetrasomie），即２n＋２；雙體中增加了２條非同源染色體，稱為雙三體（ditrisomic），即２ｎ＋１＋１。非整倍體在遺傳學研究和育種試驗上均有很大的作用。例如，單體使１條染色體失去了同源染色體而處于半合子（semizygote）狀態(tài)，此時一些等位基因就可以直接顯現(xiàn)出來，出現(xiàn)假顯性效應。異源六倍體普通小麥的染色體數(shù)目為２n＝42。減數(shù)分裂的產物中只有，n＝21和n－１＝20的大孢子能發(fā)育成有生活力的卵細胞。這種n－１的細胞中缺失的１條染色體可以是21條染色體中的任何一條。這樣用單倍體母體與正常小麥雜交，在雜交后代中就可能出現(xiàn)各種不同的單體，這些單體各有特定的性狀，其染色體數(shù)目雖不是整倍數(shù)，但仍能繁殖，因此是育種的一種方法。8.2.2染色體結構的改變染色體結構的改變起因于染色體斷裂，隨后以不正常的組合方式重接，從而導致產生各種結構異常的染色體。在自然條件下，染色體發(fā)生斷裂的頻率是很低的；但電離輻射、化學物質和病毒等因素可以明顯提高染色體斷裂的頻率。這些可誘發(fā)染色體斷裂的因子，統(tǒng)稱為誘裂劑（clastogen）。染色體結構改變或稱染色體畸變（chromosomeaberration），分為穩(wěn)定畸變和不穩(wěn)定畸變兩大類。穩(wěn)定畸變可通過細胞分裂穩(wěn)定遺傳，繼續(xù)保留在子細胞中；不穩(wěn)定畸變則會在細胞分裂過程中丟失。穩(wěn)定畸變的類型有多種，包括缺失、重復、倒位、易位、插入和等臂染色體等。不穩(wěn)定畸變則包括雙著絲粒染色體、斷片和環(huán)狀染色體等。當?shù)刮弧⒁孜坏确€(wěn)定畸變通過生殖細胞傳遞給子代時，就出現(xiàn)家族性染色體畸變。缺失缺失（deletion）指染色體的部分丟失。按照染色體上缺失的位置可分為末端（或頂端）缺失和中間缺失。末端缺失是染色體一次斷裂，中間缺失則是二次斷裂并伴有染色體斷端重接。缺失片段如不含著絲粒的稱為無著絲粒斷片（fragment），將在隨后的細胞有絲分裂過程中丟失。具缺失畸變染色體的個體，由于缺少了原來載在缺失區(qū)段上的那些基因，有害于生物體的生長和發(fā)育。缺失片段小時，可能會造成假顯性現(xiàn)象。缺失純合體通常難以存活，缺失雜合體的生活力很差。含缺失染色體的配子體一般是敗育的，花粉尤其如此。含缺失染色體的花粉即使可育，在授粉和受精過程中也競爭不過正常雄配子。缺失純合體在減數(shù)分裂時能正常聯(lián)會和分離，二價體在偶線期和粗線期無特殊的構型出現(xiàn)。末端缺失雜合體減數(shù)分裂聯(lián)會時，正常染色體某一區(qū)段因缺少同源區(qū)段不能聯(lián)會。中間缺失雜合體在聯(lián)會時，二價體會形成環(huán)或瘤，這是正常染色體未缺失區(qū)段向外突出引起的，這種情形可借助顯微鏡來觀察。但二價體出現(xiàn)環(huán)或瘤時，還須參考染色體的長度、著絲粒位置、染色粒和染色節(jié)的正常分布等加以鑒定。細胞學鑒定微小的中間和末端缺失是很困難的。此外，環(huán)狀（ring）染色體是一種特殊類型的染色體缺失。當一條染色體的長臂和短臂各發(fā)生一次斷裂，兩個斷裂相互連接就會形成有著絲粒的環(huán)狀染色體。重復重復（duplication）是指染色體的某一區(qū)段有額外的重復拷貝。重復是比缺失更為常見的染色體畸變，對個體造成的損害一般小于缺失。根據(jù)染色體帶型分析，可以分辨出正向重復，即重復的區(qū)段與原先的取向一致；或反向重復，即重復的區(qū)段與原先的取向正好相反。重復除了發(fā)生在染色體的某一區(qū)段外，也可出現(xiàn)染色體組的重復，這是因為染色體復制后細胞質不分離而形成四倍體細胞。這種情況稱為細胞核內復制（endoreduplication）。重復擾亂了基因間固有的平衡關系，并可引起基因作用的劑量效應（dosageeffect），使重復區(qū)段所載的相關基因表達量增加，從而引起對應的表型得到加強。重復和缺失可以是起因于染色體的不等交換（unequalcrossingover）。這是當一條染色體上的相鄰區(qū)段內有相似的ＤＮＡ序列時，兩條同源染色體未能正確地配對，在錯配區(qū)發(fā)生了染色體交換（crossingover），結果是一條染色體上出現(xiàn)重復，另一條染色體上出現(xiàn)缺失，分別進入兩個配子?？捎脵z查缺失的方法來檢查重復染色體。若重復區(qū)段較長，重復雜合體聯(lián)會時，重復區(qū)段被排擠出來，也形成環(huán)或瘤，與缺失相似，但與正常染色體的長度不同。若重復區(qū)段很短，聯(lián)會時重復區(qū)段可能收縮一點，正常染色體在相對區(qū)段可能伸長一點，二價體不會有明顯的環(huán)或瘤。倒位倒位（inversion）是由于同一條染色體上發(fā)生了兩次斷裂，產生的斷片顛倒180°后重新連接造成的。如果倒位發(fā)生在染色體的一條臂上，稱為臂內倒位（paracentric）；如果倒位包含著絲粒區(qū)，則稱為臂間倒位（pericentric）。臂內倒位不改變兩個臂的長度，要用染色體顯帶技術才能識別；臂間倒位則使兩個臂的長度出現(xiàn)增減，即使未作染色體顯帶技術處理也可觀察區(qū)分。在減數(shù)分裂中，正常染色體同倒位染色體之間發(fā)生交叉互換，會使配子染色體上某一區(qū)段缺失或重復，從而造成染色體異常，導致子代出現(xiàn)異常性狀。這是因為倒位雜合子在減數(shù)分裂時，兩條同源染色體不能以直線形式配對，一定要形成一個圓圈才能完成同源部分的配對，這個圓圈稱為倒位環(huán)（或倒位圈，iriversionloop，圖8.2.1）。一個倒位雜合體如果著絲粒在倒位環(huán)的外面，由在減數(shù)分裂后期會出現(xiàn)“斷片和橋”的現(xiàn)象，即一條染色單體的兩端都有一個著絲粒，成為跨越兩端的“橋”，同時伴隨一個沒有著絲粒的斷片?！皹颉痹谌旧w移向兩極進入子細胞時被拉斷，造成很大缺失；斷片則不能進入細胞的核內，由此形成的配子往往是死亡的。一個倒位雜合體如果著絲粒在倒位環(huán)的里面，在環(huán)內發(fā)生交換后，雖然不會出現(xiàn)“橋”和斷片，但也會使交換后的染色單體帶有缺失或重復，形成不平衡配子。這種配子一般也沒有生活力。在倒位雜合子的倒位環(huán)內發(fā)生單線一次交換的產物不能形成有功能的配子。如在倒位環(huán)內發(fā)生兩線雙交換，最終并沒有缺失和重復，因而是正常的。這樣，倒位看似可以抑制倒位環(huán)內的基因發(fā)生重組，其實這只是由于單線一次重組的產物是不能存活的。利用倒位的交換抑制效應，可以保存帶有致死基因的生物品系。試驗用品系一般都是以純合子形式保存，因為這是真實遺傳的，但致死品系只能以雜合子形式保存下來，原因在于純合是致死的。易位易位（translocation）主要有兩種類型：相互（reciprocal）易位和羅伯遜（Robertsonian）易位。相互易位是兩條非同源染色體之間互換一個區(qū)段，即兩條染色體同時發(fā)生斷裂，斷下的區(qū)段相互交換重接。如果在斷裂重接過程中，沒有丟失染色體片段，稱為平衡易位。平衡易位一般不產生表型效應，但會產生染色體不平衡的子代。羅伯遜易位是在兩個端著絲粒染色體之間發(fā)生的。當兩個端著絲粒染色體在著絲粒區(qū)發(fā)生斷裂后，往往會丟失異染色質的短臂，而長臂則在著絲粒區(qū)相互重接。因此，平衡的羅伯遜易位個體所攜帶染色體數(shù)目少一條。相互易位的染色體在細胞減數(shù)分裂同源染色體配對時，會出現(xiàn)十字型圖像，并將產生染色體不平衡的配子和異常的子代（圖8.2.2）。染色體易位的結果也改變了原來基因間的連鎖關系，使本來在不同染色體上的基因由色體易位而處在相互鄰接的位置上，特別是染色體斷端和重接位置上的基因，這種易位會產生明顯的表型效應。羅伯遜易位有時也稱羅伯遜融合（Robertsonianfusion），即兩條非同源的端著絲粒染色體融合為一條染色體。當一條染色體分裂為兩條染色體時，稱為羅伯遜裂解（Robertsonianfission，圖８.2.3）。融合和裂解改變了染色體數(shù)目，但是一般不增加或減少基因數(shù)目。染色體融合比染色體裂解更常見。從生物進化觀點看，以第一個提出“融合是減少染色體數(shù)目的一種機制”的羅伯遜的名字命名的羅伯遜變化是普通現(xiàn)象。8.2.3基因突變和表觀遺傳變異生物體可以在兩個水平上發(fā)生遺傳變化，一種是8.2.1和8.2.2中提到的染色體畸變，是一般可在光學顯微鏡的分辨范圍內觀察到的染色體結構的改變；另一種是基因突變，這是發(fā)生在基因結構中的變化，通常無法用顯微鏡直接觀察，而只能通過化學反應測得。基因突變是指基因的一種等位形式變成另一種等位形式，突變是相對于正常而言的。在遺傳學研究中，將自然界中普遍出現(xiàn)的性狀或指定試驗用的某一品系的性狀，作為“野生型”或“正?！钡男誀?。與這種性狀相關的等位基因稱為野生型等位基因，一般記為＋，或a＋、B＋等。任何不同于野生型等位基因的稱為突變型等位基因。從野生型變?yōu)橥蛔冃?，稱為正向突變（forwardmutation）；反之，從突變型也可變回野生型，則稱為回復突變（backmutation）或逆向突變（reversemutation）?；蛲蛔兛煞肿园l(fā)突變（spontaneousmutation）和誘發(fā)突變（inducedmutation）。自發(fā)突變指在自然狀態(tài)下基因發(fā)生的突變。自發(fā)突變的產生并不是沒有原因的，自然界的各種輻射、環(huán)境中的化學物質、生物體內的ＤＮＡ復制錯誤、ＤＮＡ自發(fā)損傷和修復能力的缺陷、轉座因子的作用等，均可引起基因自發(fā)突變。上述這些理化生物因素，按照人為設計的條件，采用試驗的手段，同樣也可使基因發(fā)生突變。通過這樣的方式產生的突變稱為誘發(fā)突變。所有能誘發(fā)基因突變的因子，稱為誘變劑（mutagen）。由于癌的發(fā)生也同基因突變密切相關，因此誘變劑往往同時也具有致癌作用，也是一種致癌物。自發(fā)突變的頻率是很低的，可用突變率（mutationrate）來表示。突變率指在一個世代中或其他規(guī)定的單位時間內一個細胞發(fā)生某一突變事件的概率。在有性生殖的生物中，突變率通常用一定數(shù)目配子中的突變型配子數(shù)來表示；在無性生殖的細菌中，則用一定數(shù)目的細菌在二次分裂過程中發(fā)生突變的次數(shù)來表示。例如，高等生物的自發(fā)突變率為（１×10－10）～（１×10－５），即在10萬到100億個配子中可能有１個突變發(fā)生。不同的生物有不同的突變率；同一生物的不同基因也有不同的突變率。基因的突變是不定向的，即突變量隨機的，也就是說，突變的效應并不對應于誘變因子的性質。例如，低溫并不引起耐寒的突變。可是，在低溫條件下，的確可以找到抗寒的作物，這是為什么呢？其實，低溫在這里只是一種選擇因子。在自然界的生物群體中，每一個體對溫度的耐受程度本來彼此間就是不同的，這也是生物多樣性的一種體現(xiàn)。在正常溫度的環(huán)境中，耐低溫的性狀無從表現(xiàn)出來，也就無法檢測出來?？墒?，當溫度降低時，不耐低溫或耐受程度較差的個體被淘汰，只有耐低溫的個體被選擇出來，生存下來，并逐漸成為群體中的主體，于是出現(xiàn)了耐低溫的生物群體。可見，突變是不定向的，只有選擇是定向的；群體基因型的定向變異是由選擇作用造成的，而不是個體的定向變異造成的。基因突變既可以由編碼序列中的核苷酸發(fā)生改變引起，也可由啟動子區(qū)、剪接部位、內含子和多腺苷酸化位置上的核苷酸發(fā)生改變引起?；蛲蛔兪巧锶后w中遺傳變異的主要來源；也是生物進化過程中自然選擇的作用對象，因而是生物進化的原材料?？墒菍τ诎l(fā)生突變的生物體而言，突變大多是有害的，它破壞了生物與生存環(huán)境之間長期形成的一種平衡和適應，因此危及生物體的生存。表觀遺傳（epigeneticｅ）變異則是另一類遺傳性變化。它是指不改變基因ＤＮＡ的核苷酸序列，而使基因表達發(fā)生可遺傳的改變?；虮磉_的改變，同樣也導致與此基因相關的性狀發(fā)生改變。點突變和移碼突變（１）點突變單堿基對置換（singlebase-pairsubstitution）也稱點變（pointmutation）。置換的方式有兩種，一種是轉換（transition），即一種嘌呤置換另一種嘌呤（），或一種嘧啶置換另一種嘧啶（）。另一種是顛換（transversion），即嘌呤和）嘧啶之間的互換。轉換比顛換更為常見。轉換和顛換如發(fā)生在基因的蛋白質編碼序列中，根據(jù)基因轉錄和翻譯產生的蛋白質可以把點突出分成以下３種：①同義突變（same-sensemutation）基因的蛋白質編碼序列中發(fā)生單個堿基對的置換突變，但沒有改變最后產生的蛋白質的結構，這類突變稱為同義突變或中性突變（neutralmutation）。產生中性突變的原因有兩個：一是點突變發(fā)生在密碼子的第３個核苷酸，由遺傳密碼的簡并性，這個突變后的密碼子恰恰同突變前密碼子編碼同一種氨基酸，這樣，突變不會改變蛋白質中氨基酸的序列；二是點突變雖然改變了所編碼的氨基酸，但是并不影響蛋白質產物原來的活性和功能，如許多同工酶（isozyme）的氨基酸組成雖有差別，但功能卻是相同的。因此中性突變不改變原來的表型。②錯義突變（missensemutation）這種點突變后，單堿基對置換形成新的密碼子，編碼另一種氨基酸，最終產生另一種蛋白質，就有可能影響、改變或丟失原有蛋白質產物的功能或獲得新的功能。這種點突變大多數(shù)發(fā)生在密碼子第1個或第２個核苷酸。③無義突變（nonsensemutation）一個編碼氨基酸的密碼子在點突變后成為一個終止密碼子，使多肽合成提前中止，產生缺失原有羧基端片段的縮短的肽鏈。在多數(shù)情況下，截短的蛋白質片段往往是沒有活性的。（２）移碼突變基因的編碼序列中發(fā)生核苷酸增加或缺失的突變，使處在突變發(fā)生位置下游的密碼子的組成發(fā)生改變，從而造成移碼突變（frameshiftmutation，圖8.2.4）。移碼突變將合成錯誤的且往往是沒有生物學活性的蛋白質，或是形成終止密碼子，使肽鏈合成提前中止。點突變通?？梢酝ㄟ^回復突變而恢復其野生型的ＤＮＡ序列。由于插入了核苷酸而引起的移碼突變，也可能通過缺失而恢復到原來的ＤＮＡ序列。但如果是由于缺失而引起的移碼突變，則一般是不可能出現(xiàn)回復突變的。當插入或缺失連續(xù)排列的核苷酸數(shù)目是３的整倍數(shù)時，其結果是密碼子的插入或缺失突變，而不引起移碼突變。這種整碼插入或整碼缺失稱為整碼突變（inflamemutation）。移碼突變同置換突變一樣都有突變熱點（hotspot），即容易發(fā)生這些突變的位點。一些研究結果指出，核苷酸序列的重復是造成移碼突變的原因；或者是重復的核苷酸序列的缺失造成移碼突變。表觀遺傳變異表觀遺傳變異是指在基因的ＤＮＡ序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達時發(fā)生可遺傳的變化，造成基因產物的改變，導致表型變化。已發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳變異有甲基化（methylation）、基因組印記（genomicimprinting）、ＲＮＡ編輯（ＲＮＡedition）等。這種遺傳變異不符合孟德爾遺傳規(guī)律。（１）甲基化在甲基化酶（methylase）作用下，將一個甲基添加在ＤＮＡ分子的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，形成５－甲基胞嘧啶，用ｍC表示。在大腸桿菌（Escherichiacoli）的研究中發(fā)現(xiàn)，含５－甲基胞嘧啶的位置常成為自發(fā)點突變的熱點，出現(xiàn)Ｇ·Ｃ轉換成Ａ·Ｔ的突變。５－甲基胞嘧啶會以相當高的頻率自發(fā)產生脫氨作用，用酮基取代氨基，使其轉變成胸腺嘧啶。ＤＮＡ甲基化與基因轉錄活性密切相關。在原核生物中，甲基化與非甲基化基因的轉錄活性相差103倍；而在真核細胞中，特別是高等生物體內的甲基化與非甲基化基因的轉錄活性相關可達106倍。甲基化特征的遺傳是通過保持甲基化酶來實現(xiàn)的。高度甲基化的基因處于失活狀態(tài)。為細胞存活所需而一直處于活性轉錄狀態(tài)的持家基因（housekeepinggene）則始終保持低水平的甲基化。在生物發(fā)育的某階段或細胞分化的某種狀態(tài)下，原先處于甲基化狀態(tài)的基因也可被誘導除去甲基化而出現(xiàn)轉錄活性。（２）基因組印記孟德爾遺傳規(guī)律認為遺傳物質無論來自雙親哪一方，都具有相同的表型效應，等位基因不會因為位于不同親代來源的染色體上而產生不同的效應。20世紀50年代末，發(fā)現(xiàn)果蠅的白眼基因座的一些等位基因在子代中有不同的表達，這取決于該等位基因來自父本還是來自于母本。小鼠核移植試驗證明，雌、雄個體的基因組對胚胎發(fā)育的作用有所不同。例如，由兩個雄原核生成的合子能發(fā)育成正常的胚外組織（extraembryonictissue），但胚胎發(fā)育很差；由兩個雌原核生成的合子能發(fā)育成正常的胚胎，但不能生成胚外結構。該結果表明卵核和精核有許多自身特有的功能。這些發(fā)現(xiàn)指出，有些基因的功能受到雌、雄雙親基因組的影響，是打上了基因組印記的。打上基因組印記的基因如處于失活狀態(tài)，稱為印記失活（imprintingoff）。如母本染色體基因印記失活，則父本染色體上的等位基因得到表達；反之亦然?；蚪M印記過程是從配子形成時開始的。某一個體表現(xiàn)出上一代遺傳下來的基因組印記的效應，但當該個體產生自身的配子時，上一代的基因組印記將被消除，而打上自身的基因組印記。產生基因組印記與ＤＮＡ甲基化和染色質結構變化有關。印記失活的基因通常是高度甲基化，表達的等位基因則是低甲基化。另外，染色質壓縮包裝成染色體時的多種因素，也可能影響到被包裝在染色質結構中的基因進入轉錄狀態(tài)。（３）ＲＮＡ編輯基因轉錄產生的ｍＲＮＡ分子中，由于核苷酸的缺失、插入或置換，基因轉錄物的序列不與基因編碼序列互補，使翻譯生成的蛋白質氨基酸組成不同于基因序列中的編碼信息，這種現(xiàn)象稱為ＲＮＡ編輯。ＲＮＡ編輯同基因的選擇剪接或可變剪接（alternativesplicing）一樣，使一個基因序列有可能產生幾種不同的蛋白質，這可能是生物在長期進化過程中形成的更經(jīng)濟有效地擴展原有遺傳信息的機制。ＲＮＡ編輯過程涉及許多酶促反應，但其機制仍不十分清楚。8.3輻射育種8.3.1輻射誘變源的種類及特性植物誘變育種中，目前常用的射線種類有：Ｘ線、γ射線、紫外線、β粒子和中子。其中除紫外線外，各種輻射通過有機體時，都能直接或間接地產生電離現(xiàn)象，故稱為電離輻射，紫外線輻射的能量不足以使原子電離，只能產生激發(fā)作用，稱非電離輻射。各種輻射由于其物理性質不同，對生物有機體的作用不一，又有其特殊性。因此，在應用時應當注意輻射的不同特性，選用合適的輻射種類。現(xiàn)將各種射線的性質列于表8.3.1供參考。用于輻射育種的射線種類輻射源及其特性續(xù)表：（１）放射性強度放射性強度也稱放射性活度，它是表示放射性核素特征的一個物理量。處在特定能態(tài)的一定量放射性核素的強度（A）是ｄN除以ｄt的商。ｄN是在時間間隔ｄt內，由核能態(tài)發(fā)生自發(fā)躍遷數(shù)的期望值，即：輻射劑量的測量放射性強度的國際制單位（ＳＩ）是貝可（Ｂｑ）。１Ｂq表示放射性核素在１ｓ發(fā)生１次核躍遷。放射性強度的單位除“貝可”外，還有與ＳＩ并用的專用單位是居里（Ｃｉ）衰變。例如，１Ｃｉ＝3.7×1010Bp。居里表示一個放射源在單位時間內有多少個原子衰變。例如，１Ｃｉ＝3.7×1010核衰變/ｓ；１ｍＣｉ（毫居里）＝3.7×10７核衰變/ｓ；１μＣｉ（微居里）＝3.7×104核衰變/ｓ。在輻射育種中，有時用β射線照射作物，并且多數(shù)采用內照射方式，一般是經(jīng)引入植物體內的放射性同位素強度表示其劑量的大小，如每粒種子引入32Ｐ10μＣｉ／粒，或每粒種子引入35Ｓ10μＣｉ／粒等。（２）照射量照射量（X）是Ｘ線和γ射線在單位質量空氣中相互作用而釋放出來的所有次級電子，當它們能完全被阻止在空氣中時，在空氣中產生同一種符號離子的總電荷量ｄQ，即照射量是表示X線和γ射線在空氣中產生電離大小的物理量，定義為ｄQ除以物質的質量（ｄm）而得的商：由于照射量的基準量中存在某些困難，因此只能用于能量為10keＶ到３MeV范圍的Ｘ線或γ射線。照射量的ＳＩ為庫（倫）每千克（Ｃ／ｋｇ）。與它暫時并用的專用單位是倫琴（Ｒ）。倫琴的定義是１ｇ空氣被Ｘ線或γ射線所照射，當其所吸收的能量為83erg（爾格）時，這１ｇ空氣所受到的照射（Ｘ線或γ射線）量就是１Ｒ。單位時間內照射量的增量為照射量率（Xｒ）。若在時間間隔ｄt內照射量為ｄX，則：照射量率的ＳＩ是庫（倫）每千克每秒（Ｃ·ｋｇ－１

·ｓ－１）。它與專用單位倫琴每秒（Ｒ／ｓ）暫時并用。（３）吸收劑量輻射的生物效應與吸收劑量的關系，要比與照射量的關系更為密切。輻射對物質的作用過程，實質上是能量轉移和傳遞的過程。例如，射線作用于種子，其能量就被種子吸收。所謂吸收劑量（D）即授予單位質量物質（或被單位質量物質吸收）的任何致電離輻射的平均能量，定義為致電離輻射授予某一體積元中物質的平均能量（ｄε，ｅｒｇ）除以該體積元中物質的質量（ｄm，g）而得的商：吸收劑量的ＳＩ是焦耳每千克（Ｊ/ｋｇ），吸收劑量的專用單位是戈瑞（Ｇｙ）。戈瑞是吸收劑量的國際單位制，定義為每１ｋｇ任何物質吸收任何電離輻射的能量為１Ｊ時的吸收劑量。１ｇ被照射物質吸收的輻射能量為100ｅｒｇ的劑量叫作１ｒａｄ（拉德）。所以有：單位時間內吸收劑量的增量為吸收劑量率（Dｒ）。若在時間間隔ｄt內吸收劑量ｄD，則：吸收劑量的ＳＩ是焦耳每千克每秒Ｊ·ｋｇ－１

·ｓ－１，吸收劑量的專用單位是戈瑞每秒（Ｇｙ／ｓ）。它與專業(yè)單位拉德每秒（ｒａｄ／ｓ）暫時并用。（４）積分流量采用中子照射作物，其劑量有的用拉德（ｒａｄ）表示，有的則以在某一中子“積分流量”之下照射多長時間表示。所謂“積分流量”是指每ｃｍ２截面積上，通過的中子總數(shù)（中子數(shù)／ｃｍ２）。8.3.2輻射誘變的作用機制（１）物理階段各種射線穿透生物體時，將發(fā)生一系列的物理作用，其最大效應是輻射的射線能量轉移，并由此產生電離作用。電離的行為可能發(fā)生在染色體內部或其四周的細胞核與細胞質的原子或分子中。

電離輻射的作用過程放射性物質放射出來的帶電粒子（如β射線）與生物大分子或原子發(fā)生非彈性碰撞，使原子中的束縛電子產生加速運動，獲得足夠能量而變成自由電子。這樣就產生了自由電子和正離子的離子對，稱為直接電離。如果束縛電子所獲得的能量還不足以使它變成自由電子，而只激發(fā)它到更高的能級，則稱為激發(fā)作用。此外，入射粒子在物質中由于直接碰撞，打出能量較高的電子，然后該電子再按上述過程產生離子對，稱為次級電離。不帶電的入射粒子（如γ射線）通過植物體時可產生次級電離。入射粒子在植物體中通過時，單位路徑產生的離子對數(shù)目為電離密度。它取決于粒子的速度和所帶電荷。電荷越多，則粒子與電子間相互作用越強，電離密度也越大；粒子速度越低，它位于電子附近的時間越長，相互作用越有效。如γ射線，其粒子穿透植物體時，在一個生物大分子中可能只形成很少幾個離子對，其電離密度小，分子受損害較小；反之，熱中子在射程的單位長度內產生很多離子對，大分子受到很多次電離，其電離密度大，分子受損害較多。Ｘ線和γ射線都是一種光子，對于物質的主要作用有光電吸收、康普頓散射和電子對的形成等。當一個低能量光子和原子相碰撞時，可能將其所有的能量傳給一個電子，使它脫離原子而運動，光子本身則整個被吸收。由于這種作用而釋放出來的電子稱為光電子，這種效應稱為光電吸收。光電子和普通電子一樣，在物質運動時與相遇的原子產生電離。當中等能量的光子與原子中的一個電子發(fā)生彈性碰撞時，光子交出自己一部分能量傳給電子，原子內的電子得到能量后就離開原子，稱為康普頓散射。康普頓電子（得到能量的電子）由于能量大大增強，在穿過物質時能引起電離。同時，光子繼續(xù)朝著其原來的方向成某種角度散射開去，稱散射光子。散射光子根據(jù)本身存在的能量值，再次與其他原子中的電子發(fā)生彈性碰撞，同樣產生新的康普頓散射或光電吸收。當高能量光子與物質相互作用，則會產生一對正負電子，光子本身整個消失，稱為電子對的生成。電子與正電子的功能一般是不相同的，可以有不同的組合。電子可使介質中的原子電離并消耗其全部能量，當正電子損失其全部功能后，將與中子結合轉化成光子，稱為光化輻射。由于中子不帶電，所以能自由地穿入原子核引起核反應。當它作用于生物體時不產生直接電離作用，而是通過沖擊原子核產生核反應，放出各種射線引起電離。中子與核發(fā)生彈性碰撞時，可將部分能量轉移給原子核而使該原子電離，變成快速的帶電離子（反沖質子）。這樣的帶電離子具有與上述帶電粒子相同的性質和作用。中子本身則由于多次碰撞而逐漸慢化，被稱為熱中子?？熘凶?、慢中子或熱中子引起核反應可以產生放射性物質、γ射線或其他粒子。如慢中子不擊出質子來，卻被其通過的物質的原子核所捕獲，則產生一個可放射出γ射線的新原子核。中子穿過物質所產生的各種射線同樣發(fā)生光電吸收、康普頓散射和電子對的生成等。中子照射植物的效應，基本上是依賴于質子和γ射線的電離作用。（２）化學階段離子對的形成標志著輻射的直接物理作用的結束以及化學作用的開始。由于活的植物組織中７５％是水，因此水就成為電離輻射最豐富的靶分子。水中的１個離子對的形成叫做射解作用，可用下列反應式表示：從水脫離出來的自由電子又可與１個正常的水分子反應形成離子Ｈ２Ｏ－：上述兩種水離子Ｈ2Ｏ＋和Ｈ２Ｏ－與水分子進一步起反應形成離子和自由基，其反應式如下：Ｈ＋和ＯＨ－是不穩(wěn)定的離子，并重新化合成水；但Ｈ·

和ＯＨ·等自由基非?；钴S，很容易與其他分子起化學反應。這些反應總稱為輻射的間接作用。在水中許多自由基相互反應，反應式如下：上述最后一個反應的產物過氧化氫是一種活潑的氧化劑，對生物系統(tǒng)關系重大。但更為重要的是Ｈ·和ＯＨ·，這些自由基能與溶質分子起反應，細胞中的這些溶質分子可以影響細胞以后的生活力。特別是在有氧的情況下，與氧結合成為活躍的自由基，例如：過氧基是一種壽命相當長的氧化物質，它能移到大分子的表面，使大分子發(fā)生通常有損于細胞功能的化學反應。研究認為，危害最大的自由基是氫原子、羥基和水化電子。由于這些自由基都是強還原劑或強氧化劑，可能改變植物體內正常的氧化還原過程，使糖類、蛋白質和酶等物質的代謝發(fā)生變化，破壞生物體原有的穩(wěn)定性，引起一系列的生物學效應。（３）生物學階段輻射在生物學方面的效應比物理和化學的效應所需要的時間要長得多，通常需要幾個世代的時間才逐漸顯示出來。輻射對細胞結構的破壞效應，首先是引起半透膜的破壞。細胞中的半透膜對細胞的功能極為重要，水分和鹽類的相互關系靠它來維持，同時它又是各種細胞器（線粒體、葉綠體、溶菌酶等）的外膜。內質網(wǎng)膜是折疊在細胞內的網(wǎng)狀膜，為核糖體、蛋白質體提供養(yǎng)分，并與它們共同合成蛋白質。輻射引起半透膜的破損，可能是由于自由基對面積甚大的膜表面作用的結果。這無疑是細胞逐漸失去活力的一個因素。從受輻射后的細胞還可以觀察到細胞核顯著膨大、染色體出現(xiàn)成團現(xiàn)象、核仁和染色質的空泡化、核膜的增厚、核質分解為具有（或無）空泡的染色質塊等現(xiàn)象。在正分裂的細胞中，會觀察到染色質黏合、斷裂及其他結構變異（如產生巨核細胞、多核細胞等）。此外，細胞質的結構成分也會發(fā)生各種物理、化學性質的變化，如黏度的改變、空泡的形成、電解質及水分的滲透性升高等。輻射還可能使某些促進細胞新陳代謝所需要的酶“失活”，引起細胞死亡。特別是某些酶本來數(shù)量較少，卻參與某些極重要的物質（如維生素和激素等）的合成，這些酶的喪失可能對細胞功能的喪失起重要作用。在細胞群體中，輻射損傷具有隨機性。有些細胞受到嚴重的損傷而引起死亡，有些細胞僅受到輕微的損傷，還有些細胞根本沒有發(fā)生電離。甚至在同一個細胞內，未受損傷的分子群有時有“接管”代謝過程并使其逐漸恢復到正常水平的能力。其結果，使復雜有機體表現(xiàn)出在受到亞致死劑量電離輻射的作用后還具有恢復的能力。甚至在很多情況下，受中等劑量輻射后，物質合成水平比受輻射前更高。輻射不僅對細胞造成傷害，影響細胞的功能甚至使細胞失去活力或死亡，而且對染色體、ＤＮＡ和ＲＮＡ的影響極大。由于染色體、ＤＮＡ和ＲＮＡ與遺傳有密切關系，因此它們受輻射后產生的異構現(xiàn)象，都會導致有機體的性狀變異。輻射引起ＤＮＡ氫鍵的斷裂，使ＤＮＡ結構紊亂，使遺傳信息的儲存和補償系統(tǒng)發(fā)生轉錄錯誤，這些錯誤最終導致有機體突變。輻射還會造成染色體數(shù)量的變化，包括因染色體整數(shù)倍的增減產生的多倍體和單倍體，以及染色體零星增減產生的非整倍體，如γ射線處理橡膠無性系使后代中出現(xiàn)２n＝45～54的個體。電離輻射的遺傳效應8.3.3輻射誘變的方法（１）外照射放射性元素不進入植物體內，而是利用其射線（Ｘ線、γ射線或中子）照射植物的各個器官。它是應用最普遍、最主要的照射方法，其最大優(yōu)點就是操作方便，利于集中處理大量材料，一般沒有放射性污染和散射問題，所以比較安全，因此在輻射育種中應用最為廣泛。外照射按處理植物的部位和方法不同，又分以下幾種：照射方法①種子照射照射方法多種多樣，可照射干、濕和萌動種子。此法操作簡單，體積小，處理數(shù)量多，并易于儲存和運輸。但從播種到開花結果時間長，植株占地面積大。供照射的種子材料應預先經(jīng)過精選，要求純度較高，不含雜物。照射后應及時播種。過早進行種子照射處理，容易產生儲存效應。如果照射干燥種子，并在干燥有氧條件下儲存，可使損傷加劇。②花粉照射照射的方法有兩種，一種先將花粉收集于容器內，經(jīng)照射后立即授粉，這種方法適用于那些花粉生活力強、壽命長的植物，可與單倍體育種結合進行；另一種是直接照射植株上的花粉，這種方法一般僅限于有輻射圃或有便攜式輻照儀的單位，可以進行田間照射。用輻射誘變的花粉進行受精，所得后代由于攜帶雜合的突變基因，便可分離出許多突變體，以供進一步篩選之用。③子房照射該法與照射花粉具有同樣的優(yōu)點，即不易出現(xiàn)嵌合體。用射線直接作用于卵細胞，對后代變異影響很大，除能引起雌性的細胞變異外，還能影響受精作用，有時可誘發(fā)孤雌生殖，產生良好的誘變效果。對自花授粉植物進行子房照射時，在照射前應進行人工去雄；對高度自交不親和的雄性不育材料照射子房時可不必去雄，更為簡便。由于卵細胞對輻射較為敏感，處理時宜采用較低劑量。④營養(yǎng)器官照射此法適應于無性繁殖植物（如薯類、鱗莖類及果樹和部分觀賞植物等）。照射的材料有塊根、塊莖、鱗莖、球莖、幼芽、枝條和嫁接苗等。該方法可大大提高突變頻率，并且與照射花粉和種子相比具有結果早、鑒定快等特點。照射的枝芽等應選擇組織健壯、芽眼飽滿的芽條，照射后嫁接易于成活。解剖學的研究和分析指出，為了減少嵌合體，受處理的芽原基所包含的細胞越少越好，照射后可得到最多的突變體。經(jīng)驗表明，初生枝第４至第８個葉片葉腋內的芽，在下一營養(yǎng)繁殖世代中，出現(xiàn)較寬的突變扇形體的頻率最高。據(jù)報道，照射蘋果剛剛開始萌動的芽比深休眠芽的效果好，前者突變頻率高。⑤植株照射可在植株一定發(fā)育階段或整個生長期，在輻射場對植株進行長期照射。鈷植物園（γ－field）是進行大規(guī)模田間植株照射的輻射育種設施，其優(yōu)點是能同時處理大量整株材料，并能在植物整個生長期內在田間自然條件下進行長期照射。由于這種照射場輻射強度極高，故必須具有嚴格的安全防護設備和措施。鈷源不用時借遙控自動裝置將其降入地下室中。受照射植物可按所需劑量大小計算出離鈷源的適宜距離，然后以鈷源為中心，按照已確定的距離，呈輻射狀同心圓種在其四周進行照射，靠近射線源的植物每天受到的照射劑量可高達10000Ｒ以上，隨著距離的增加，劑量也相應降低。在鈷植物園中處理的一年生植物，受照射達一定劑量后可栽植到無處理區(qū)，必要時也可留在鈷植物園內直至結實，次年將其種子播種于無處理區(qū)。其他植物器官組織的照射其他的植物器官和組織，如葉片、愈傷組織、花藥、合子以及細胞、原生質體等均可作為照射的材料，可結合植物組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)進行。（２）內照射將一定量放射性同位素引入植物體內，使其所放射出的射線在植物體內進行照射，稱為“內照射”。該方法需要一定防護條件，易造成污染和提高環(huán)境的放射性“本底”，而已被吸收的劑量不易精確測定，故應用受到一定限制。但內照射具有劑量低、持續(xù)時間長、大多數(shù)植物都可以在生育階段處理等優(yōu)點。進入植物體內的放射性元素，除其本身釋放的放射性效果外，還要考慮到由衰變產生的新元素的“蛻變效應”。通常用作內照射的放射性同位素，主要有32Ｐ、35Ｓ、45Ｃａ（放射β射線），以及65Ｚｎ、60Ｃｏ（放射γ射線）等。內照射的方法一般有以下幾種：①浸種法將放射性同位素配制成一定強度比例的溶液，對需誘變的種子或枝芽進行浸泡。為確定放射性溶液用量，使種子吸脹時能將溶液全部吸干，種子需先進行吸水量試驗。放射性溶液所用劑量范圍一般是0.1～10μＣｉ／粒。②施入法用放射性同位素作“超微量元素”施入土壤（如32Ｐ磷肥），植物在吸收肥料時，便可將其吸入體內。③涂抹法用放射性同位素溶液與適當?shù)臐駶檮┡浜?，涂抹在植物體上或浸泡植物葉片、嫩梢，通過根外吸收，將放射性同位素引入植物體內。④注射法用注射器將放射性同位素溶液注入植物組織內（如嫩枝、幼芽、花蕾、塊莖、鱗莖等）。⑤在示蹤研究的植株上采種子或枝條例如，用32Ｐ進行肥料試驗或用14Ｃ進行光合試驗的植株，其體內和所結種子均接受過同位素的內照射，也可用作輻射誘變的研究材料。（３）間接照射又稱培養(yǎng)基照射或培養(yǎng)液照射。用射線照射純水、培養(yǎng)液或培養(yǎng)基，然后將萌發(fā)的種子或其他植物材料放入其中處理；亦可先照射種子或其他植物組織，在低溫下提取其浸出液，再以此提取液浸漬未經(jīng)照射過的種子或其他植物材料。兩種方法均可引起染色體畸變，在微生物誘變育種中應用較多。（４）快照射和慢照射快照射和慢照射是根據(jù)照射劑量強度劃分的，前者是在短時間內進行高劑量照射，后者是在長時間內進行低劑量緩慢照射。對劑量強度要視被處理植物（細胞）代謝活性而定。代謝活性弱（如休眠種子），無論是快照射、慢照射還是間斷照射，如果總劑量相同，效果也會相同。但如果代謝活性強，則慢照射效果差，這是由于有恢復能力的原因。適宜的劑量是指能夠最有效誘發(fā)育種者所希望獲得的那種變異類型的照射量。確定適宜的輻射劑量是誘變處理成敗的關鍵，同時又是一個極為復雜的問題，受多種因素的影響，應遵循一定的原則。它因作物種類、照射器官、植物生長期和所處的生理狀態(tài)以及其他許多內因、外因的不同而異。適宜劑量和劑量率的確定在輻射育種中，一般隨著輻射劑量增加，變異率也會增加，但致死率也隨之提高。若輻射劑量超過一定限度就會導致處理材料全部死亡，這時的劑量稱為“致死劑量”（LD100）。選擇適宜輻射劑量的一般做法是以發(fā)芽率（或幼苗生長勢）為指標，找出發(fā)芽率為對照（無處理）一半時的劑量，即照射種子或植物某一器官的成活率占50％的劑量，稱“半致死劑量”（LD50），以此為中心增高或降低試驗劑量。照射種子或植物某一器官成活率占40％的劑量稱“臨界劑量”（LD60）。實踐中大多以臨界劑量作為選擇適宜劑量的標準，但也有人主張采用比臨界劑量低的劑量，因為劑量過高不僅導致照射第１代植株的大量死亡，外因素極為復雜，而且至今尚未研究清楚，所以目前并沒有公認的權威數(shù)據(jù)?，F(xiàn)根據(jù)國內、外研究的結果，綜合列于表8.3.2供參考。8.3.4輻射育種程序目前輻射處理還難以實現(xiàn)“定向突變”，為了提高輻射育種的效果，關鍵是要正確地選擇輻射處理的親本材料，才能取得理想的效果。為了實現(xiàn)不同的育種目標，應選用具有不同特點的親本材料類型進行誘變處理。例如，為了選育抗病毒?。ㄈ纾裕停?、ＣＭＶ）的番茄優(yōu)良品種，則親本材料應該是豐產、優(yōu)質、成熟期適宜，最好還能抵抗除病毒病以外的其他主要病害的品種，否則便不易達到預期的育種目的。處理材料（原始材料及處理器官）的選擇為增加輻射育種成功機會，選用的處理材料應避免單一化，因為不同品種或類型，其內在遺傳基礎存在著差異，對輻射敏感性也不同，因而誘變的突變率和突變類型以及優(yōu)良變異出現(xiàn)機會和優(yōu)良程度等也有很大差別。所以在條件許可下，應適當多選幾個親本材料為好。如果是為了獲得新變異，供作雜交親本之用，也一定要選擇綜合性狀優(yōu)良的親本材料進行處理。至于每個親本材料處理的種子數(shù)量則應根據(jù)處理劑量高低、不同材料輻射敏感性強弱、有用突變率高低、人力、物力等客觀條件靈活掌握，總的原則應是保證獲得足夠數(shù)量的成活變異植株，以便為進一步篩選有益變異提供適當?shù)倪x擇群體。例如，有用突變率預期為10-３，用半致死劑量處理種子，則估計需處5000～10000粒，才能期望有95％～99％的概率在處理群體內有１株有用突變個體。處理的親本材料綜合性狀應優(yōu)良，且只有一、兩個需要改進的缺點，而不應是缺點很多、僅具有少數(shù)突出優(yōu)點的材料。這主要是由輻射育種的特點所決定的。為此，通?？蛇x用當?shù)厣a上推廣的良種或育種中的高世代品系作為誘變材料。此外，也有人主張可選用具有強優(yōu)勢的、綜合性狀優(yōu)良的雜種一代或有前景的雜種后代作誘變材料。適當選用單倍體、原生質體等作誘變材料，發(fā)生突變后易于識別和選擇。突變一經(jīng)選出，將染色體加倍后即可使突變純化，可顯著縮短育種年限。但是單倍體生活力較弱，誘變中死亡率較高，加倍較困難，繁殖系數(shù)較小，所以采用的劑量不宜過高，并應對誘變材料提供適宜的營養(yǎng)和環(huán)境條件。此外，也可用單細胞或原生質體作誘變材料，與細胞培養(yǎng)相結合，以避免正常細胞與突變細胞的競爭，從而提高突變育種的效果。有性繁殖植物種子（胚）經(jīng)誘變處理后長出的植株，稱為Ｍ１（突變１代）植株。Ｍ１植株通過配子受精最后形成種子即為Ｍ2（突變２代）。Ｍ2入選的突變體繁殖的后代為Ｍ3。以此類推。無性繁殖植物突變世代的劃分，一般以營養(yǎng)繁殖的次數(shù)作為突變世代數(shù)。無性繁殖植物的親本世代、突變世代、突變２代、突變３代，分別以ＶＭ0（或Ｍ0）、ＶＭ1（Ｍ1）、ＶＭ2（Ｍ2）…等符號表示，或簡寫為V0、V1、V2、V3

…等。突變世代的劃分各世代群體的大小是關系到能否選擇到所需突變體的重要問題。群體過小，后代的選擇概率太低，不易選到所需的突變體；群體過大，耗費人力、物力，增加工作量。究竟多大的群體才合適，要根據(jù)具體作物種類及所需獲得的突變類型、突變頻率、突變體數(shù)目等因素決定。因此，在進行誘變育種前，對各世代群體進行一些估計是必要的。對于單基因突變，假定其突變率為u，至少要發(fā)生１個突變的概率水平為p１，則被鑒定的處理細胞數(shù)目n可從下列公式算出：分離世代群體數(shù)量的估計突變可在被輻射細胞的后代中發(fā)現(xiàn)，而二倍體植物存在的隱性突變在Ｍ2才能表現(xiàn)出來。如果輻射材料具有50％致死效應，則２n的值代表提供Ｍ2株系所需的Ｍ1植株數(shù)。每個Ｍ2株系植株數(shù)（m）是由分離比例（a）和至少能產生１個純合突變體的概率（p２）來決定的。根據(jù)各種a及p２的值可以計算出Ｍ2各株系的應有植株數(shù)（m）：把上述兩個公式合并起來，可以計算出群體的應有大小。但從實用觀點看，很少能正確預測突變率，應用該公式計算的僅僅是一個粗略預測。但是，對于鑒別有實用價值的數(shù)量性狀變異所需群體數(shù)目的計算是比較困難的，因為既不能確定所包括的基因數(shù)目，也不能確定在Ｍ２中加以鑒別的最低效果的數(shù)量。根據(jù)一般的突變率和突變體在后代出現(xiàn)概率，有人計算在自花授粉作物中，為獲得１個多基因控制的數(shù)量性狀突變體，在Ｍ２需要1000～5000株；獲得１個帶有幾個隱性基因控制的復雜性狀突變體，其Ｍ２需要50萬株左右；獲得１個單隱性基因控制的性狀突變體，Ｍ２多達10萬～50萬株；獲得１個單顯性基因控制的性狀突變體，Ｍ２多達１５０萬株。隨著誘變方法的不斷完善，提高誘變育種效率的關鍵已不再是如何提高突變頻率，而是如何以簡單有效的手段檢測出優(yōu)良的突變體。目前在誘變育種實踐中，對突變體鑒定的方法主要有以下幾種：（１）形態(tài)鑒定誘變育種最常用方法，即將所獲得的突變體與原品種一起種植于田間，在主要生育期目測或借助簡單工具進行觀察、記載和比較。很多突變性狀，如熟期、株高、花數(shù)、果數(shù)、果大小等，可通過這種方法從形態(tài)上直接或間接識別。由于氣候、土壤、肥料、種植密度等都會引起性狀變異，從而造成不同年份間和不同材料間的性狀差異，給突變體鑒定帶來一定困難。迄今為止，形態(tài)鑒定還缺乏統(tǒng)一標準，各單位都是按照各自實際情況來鑒定突變體。突變體鑒定和選擇（２）生理生化鑒定生理特性和品質突變體可借助于如蛋白質、氨基酸、糖等的含量分析來鑒定。這種鑒定工作量往往很大，可借助相應的自動化儀器來完成。同工酶是有機體內酶的多種分子形式，是基因調控表達的結果。野生型與突變型之間同工酶的差異，反映了它們之間遺傳基礎的差異，因而通過利用各種凝膠電泳鑒定同工酶譜異同來鑒別突變種質資源是十分有效的。但在實際工作中要注意，用于鑒定突變體的同工酶必須穩(wěn)定性好，不受外界條件影響，以保證結果準確可靠。（３）分子標記鑒定詳見本教材第９.４節(jié)相關內容。（４）遺傳鑒定為了鑒定早熟、矮稈、抗病性等突變體的遺傳特性及其在育種上的利用價值，可將突變體與原品種及其他親本雜交、回交，確定控制突變性狀的顯隱性和基因數(shù)目以及該性狀的遺傳規(guī)律和遺傳率，一般來說，遺傳學鑒定要在上述形態(tài)等鑒定的基礎上進行。（５）抗性突變體的離體篩選鑒定可利用誘變方法和生物離體培養(yǎng)技術篩選鑒定抗病、抗逆突變體。其要點是先對培養(yǎng)材料進行誘變處理，然后培養(yǎng)在添加一定濃度的病原物、病毒菌產生的致病毒素或其他脅迫因子的培養(yǎng)基中。正常情況下，大多數(shù)細胞由于生長受到抑制而逐漸消失，只有少數(shù)發(fā)生突變的細胞才能在這種不利環(huán)境中正常生長分化，通過連續(xù)培養(yǎng)后長成植株。這種方法處理群體大，有利于多種誘變劑的應用，能使突變體基因在細胞水平上表達，便于進行單細胞選擇和突變體的早期篩選鑒定，可以顯著提高誘變育種效率。在輻射育種中，由于有利變異出現(xiàn)頻率很低，而且突變多為隱性，所以要準確無誤地發(fā)現(xiàn)突變，選出有利變異是較為不易的。必須遵循細胞遺傳學原理，按照一定育種程序進行工作，才能達到目的。（１）以種子為輻射處理材料者將待處理的種子按不同的輻射劑量分別播種，為Ｍ1。由于突變多屬隱性，可遺傳的變異在Ｍ1通常并不顯現(xiàn)，Ｍ1所表現(xiàn)的變異多為高能射線所造成的生理變異（特別是生理損傷和畸形），這些變異無論優(yōu)劣，一般并不遺傳，因此Ｍ1不必進行選擇淘汰，而應全部留種。Ｍ1植株應隔離，使其自花授粉，以免有利突變因雜交而混雜。經(jīng)輻射處理的種子應在15～30天播種，不宜拖延太久。輻射育種的基本程序Ｍ2的播種及鑒定：由于照射種子所得的Ｍ1常為“嵌合體”，故對Ｍ1最好能分果或分穗時分別采收種子，然后每果（穗）分別播種成一個小區(qū)，稱為“穗系區(qū)”，以利于以后計算變異頻率并易于發(fā)現(xiàn)各種不同變異。由此可見，Ｍ2的工作量是輻射育種中最大的一代，為了獲得有利突變，通常Ｍ2要有幾萬個植株，每一Ｍ1個體的后代（Ｍ2）種植20～50株。因為隱性突變經(jīng)一代自交至Ｍ2便可顯現(xiàn)出來，故對Ｍ2的每一個植株都要仔細觀察鑒定，并且標出全部不正常的植株，對于發(fā)生了變異的果（穗）行（每行有１～５株發(fā)生突變），則從其中選出有經(jīng)濟價值的突變株留種。Ｍ3的播種及鑒定：將Ｍ2中各個變異植株分株采種，分別播種一個小區(qū)，稱為“株系區(qū)”，以進一步分離和鑒定突變。一般在Ｍ3已可確定是否真正發(fā)生了突變，并可確定分離的數(shù)目和比例，同時可測每株產量作為突變株產量的初步概念。因為在Ｍ2中入選的植株不會很多，所以Ｍ3工作量較小。在Ｍ3中鑒定淘汰不良“株系”，在優(yōu)良“株系”中再選出最優(yōu)良單株。Ｍ4及Ｍ5的播種及試驗：將優(yōu)良Ｍ3株系中的優(yōu)良單株分株播種成為Ｍ4，進一步選擇優(yōu)良的“株系”，如果該“株系”內各植株性狀表現(xiàn)相當一致，便可將該系優(yōu)良單株混合播種為一個小區(qū)，成為Ｍ5，至此突變已告穩(wěn)定，便可與對照品種進行品種比較試驗，最后選出優(yōu)良品種。（２）以花粉為輻射材料者由于花粉的生殖核可以認為是一個細胞，所以當輻射處理后，如果花粉產生突變，就是整個細胞發(fā)生了變異，用它授粉所得的后代整個植株便可帶有這種變異，不會出現(xiàn)遺傳上的嵌合體，故當用Ｍ1的種子播種Ｍ2時，不必分穗（果）播種，只要以植株為單位分別播種為株系區(qū)即可，每一個Ｍ2系種植10～16株，其他程序同上。（３）以營養(yǎng)器官為輻射對象者無性繁殖材料多為異質，因此輻射處理后發(fā)生的變異在當代就可表現(xiàn)出來，所以后代選擇可從Ｍ1進行。同一營養(yǎng)器官（如枝條）的不同芽對輻射的敏感性及反應不同，可能產生不同變異，故輻射后同一枝條上的芽要分別編號、分別繁殖，以后分別觀察其變異情況，如果發(fā)現(xiàn)有利突變，便可用無性繁殖法使之固定成為新品種。在無性繁殖下不會產生分離，故果樹、薯類及某些觀賞植物等無性繁殖植物的輻射育種程序極為簡單。但是，無性繁殖植物經(jīng)誘變處理后，突變細胞和其他細胞會發(fā)生競爭。由于突變細胞開始有絲分裂時受到抑制和延遲，因而不易表現(xiàn)出來。應采取一些人工措施，創(chuàng)造有利于變異體細胞生長發(fā)育的條件，促使它增殖，如多次摘心、修剪等。8.4化學誘變育種化學誘變劑（chemicalmutagens）是指那些能與生物體的ＤＮＡ發(fā)生化學反應，使后代產生變異的化學物質。化學誘變育種是指采用化學誘變劑處理一定的植物材料，以誘發(fā)植物遺傳物質的突變，進而引起植物特征、特性的變異，然后根據(jù)育種目標，對這些變異進行鑒定、培育和選擇，最后育成新品種的育種途徑。與輻射誘變比較，化學誘變主要有以下特點：（１）使用經(jīng)濟方便化學誘變處理只需要少量藥劑和簡易設備即可開展工作。當沒有Ｘ光機或更昂貴的γ（或其他）射線源而不能進行輻射育種時，仍可借助化學誘變方法進行誘變。

8.4.1化學誘變的特點（２）具有一定的專一性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同藥劑對不同植物、組織或細胞，甚至對染色體節(jié)段或基因的誘變作用具有一定的專一性。如馬來酰肼對蠶豆第Ⅲ染色體第14段特別起作用；而乙醇則對其第Ⅳ染色體第19段的作用特別有效，都能誘發(fā)很多染色體的畸變。在同一條件下，不同基因的突變頻率有時相差幾百倍。資料表明，在某種化學誘變劑作用下，可優(yōu)先獲得一定位點的突變。如鹽酸肼處理番茄較鹽酸胲能獲得更多矮生突變。不同誘變劑的這種“特殊”功能，看來比輻射要明顯一些。不過在實際應用中尚未完全解決，但這有可能是解決定向突變的一條途徑。（３）化學誘變與輻射誘變的突變譜很不相同許多作者指出，用輻射處理大麥（特別是用快中子處理后）所產生的綠葉突變譜較窄，而且大多是白化突變類型；用化學誘變劑處理則能產生較寬的突變譜，其中白化突變的百分率顯著下降。此外，用化學誘變劑ＥＩ處理，較γ射線處理可提高下一代育性達３倍多。（４）誘變機制不同輻射誘變是由射線的高能量造成的，而化學誘變劑則是由其化學特性與遺傳物質發(fā)生一系列生化反應造成的；輻射處理的特點是能夠獲得廣泛的染色體結構突變譜，而化學誘變劑造成的突變則更多的是基因點突變。由于化學誘變劑能誘發(fā)更多的“點突變”，而幾乎不產生染色體畸變，所以化學誘變劑更為適用。射線對ＤＮＡ或染色體的作用一般是在照射時發(fā)生的；而化學誘變劑的作用則是在較晚時期發(fā)生的，即所謂“遲發(fā)突變”。此外，不同個體、組織或細胞對射線和化學誘變劑的敏感期也有顯著的差異。（１）烷化劑這類誘變劑是在誘變育種中應用最廣泛的一類化合物。它帶有１個或多個活躍烷基，這些烷基能轉移到其他電子密度較高的分子（親和中心）中，通過烷基置換取代其他分子的氫原子，稱為“烷化作用”。它們借助于磷酸基、嘌呤基、嘧啶基的烷化而與ＤＮＡ或ＲＮＡ起作用，進而導致“遺傳密碼”改變。堿基經(jīng)常發(fā)生的改變是形成７-烷基鳥嘌呤。烷化劑的又分為以下幾類：①芥子氣類芥子氣類的化學藥品主要有氮芥類和硫芥類兩類。8.4.2化學誘變劑的種類、特性和誘變機制氮芥類：通常為鹽酸化合物，種類很多。有三（2-氯乙基）胺（氮芥B）［N（CH2CH2CL）3］，（2-氯乙基）甲基胺（氮芥Ａ）［CH3Ｎ（CH2CH2CL）］，雙（2-氯乙基）胺［ＨＮ（CH2CH2CL）2］，雙（2-氯乙基）甲胺氧化物［CH3ＮＯ（CH2CH2CL）2］，２-氯乙基雙甲基胺［（CH3）2ＮCH2CH2CL］等。硫芥類：有芥子氣［S（CLCH2CH2）2

］、氯乙基·乙硫醚（CH3CH3SCH2CH2CL）、硫芥Ｃ［Ｏ（CH2CH2ＳCH2CH2CL）２］等。

這類藥劑均屬于烷化劑，它們都有１、2或３個活性基（活躍的烷基）。據(jù)認為其誘變機制是引起染色體畸變。如硫芥的產物能在ＤＮＡ雙螺旋的兩條鏈之間形成交聯(lián)而阻止ＤＮＡ兩條鏈的解離，妨礙復制的進行，造成遺傳變異。②次乙亞胺和環(huán)氧乙烷類這類化合物誘變作用很大，主要有次乙亞胺（乙烯亞胺）、乙酰乙烯亞胺、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、１，2-環(huán)氧丁烷、3，4-環(huán)氧丁烷等幾種。這些藥劑也是一類烷化劑。研究認為，它們會產生遺傳效應是由于這些藥劑可使ＤＮＡ磷酸基起烷化作用，其反應生成物是極不穩(wěn)定的，迅速水解成磷酸酯和脫氧核糖，造成ＤＮＡ鏈斷裂。這類藥劑也可與嘌呤或嘧啶起烷化作用，造成脫氧核糖和堿基之間的鏈斷裂。失去堿基的ＤＮＡ不穩(wěn)定，又可造成脫氧核糖和磷酸鏈的斷裂，進而引起ＤＮＡ鏈的斷裂。③烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽類這是一類具有很強誘導變性能力的重要烷化劑，是一類烷基化合物。如乙基磺酸甲烷（ＥＭＳ）、乙基磺酸乙烷（ＥＥＳ）、甲基磺酸甲烷（ＭＭＳ）、丙基磺酸丙烷（ＰＰＳ）、甲基磺酸丙烷（ＰＭＳ）、甲基磺酸丁烷（ＢＭＳ）等。與這類烷基磺酸鹽類作用相似的有另一類磺基硫酸類化合物，如硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、硫酸二甲酯（ＤＭＳ）、硫酸甲乙酯（ＭＥＳ）等。它們的誘變機制與上述烷化劑相似，主要是它們的活性功能與“遺傳物質”起烷化作用，從而造成ＤＮＡ復制時的紊亂以及ＤＮＡ鏈斷裂或染色體交聯(lián)等。例如，甲