第三部分細胞培養(yǎng)與細胞融合

第三部分細胞培養(yǎng)與細胞融合2第一部分植物細胞分離與培養(yǎng)1、物理方法2、化學方法3、酶法一、植物細胞得分離31、物理方法將疏松得愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中,經(jīng)搖床不斷振動,使細胞分散。若向細胞懸浮液中吹入脈沖壓縮氣體,細胞分散得更好。2、化學方法就是在細胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鹽(能結合細胞間質中果膠鈣得鈣離子)、秋水仙素(0、1mmol/L)或2,4-D或水解乳蛋白(對細胞分散有一定得作用)。3、酶法利用果膠酶和纖維素酶使細胞分離。4單細胞培養(yǎng):平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、微室培養(yǎng)(微滴培養(yǎng))等據(jù)培養(yǎng)基形態(tài):分為固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)(懸浮培養(yǎng))細胞固定化培養(yǎng):二、植物細胞得培養(yǎng)5此法適用于難于培養(yǎng)得植物種類

優(yōu)點：簡便、成功率高缺點：不能在顯微鏡下直接觀察6

優(yōu)點:可以連續(xù)觀察細胞得分化和發(fā)育;

缺點:通氣性差,水分難保持,pH易變動。

7一)、懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)

定義:就是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖得技術。懸浮培養(yǎng)得過程8一就是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液得接觸面,改善營養(yǎng)供應;二就是在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生得有害物質在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒害;三就是振蕩培養(yǎng)可以適當改善氣體得交換;1、懸浮培養(yǎng)得優(yōu)點:9

懸浮培養(yǎng)物分散性良好,細胞團較小;

均一性好,細胞形狀和細胞團大小大致相同;

細胞生長迅速(2～3天加倍)。2、一個成功得懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足怎樣得條件？103、懸浮細胞培養(yǎng)方法

分披培養(yǎng)法

半連續(xù)培養(yǎng)法

連續(xù)培養(yǎng)法大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜12起始愈傷組織得質量;接種細胞密度;培養(yǎng)條件:方式、溫度;繼代周期。4、影響懸浮細胞生長得因素有哪些？13定義:即把細胞固定在一種惰性基質上,細胞不能運動而培養(yǎng)液可在細胞間流動以供應營養(yǎng)。按照其支持物不同可以分為兩大類:

A、包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng):瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺;

B、附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng):尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維。二)、細胞固定化培養(yǎng)

固定化細胞培養(yǎng)特點(見P112)14

流化床生物反應器:細胞包裹在膠粒、泡沫顆粒中,通入空氣使固定化細胞懸浮于反應器中。

填充床生物反應器:細胞固定在膠粒、泡沫顆?；蜻B續(xù)得多個網(wǎng)中,細胞固定不動,通過流動得培養(yǎng)液傳質。常見得幾種固定化培養(yǎng)系統(tǒng)出口進口填充床生物反應器出口進口流化床生物反應器15

膜生物反應器:－－常見得就是中空纖維和螺線式卷繞反應器,傳質效率低,易阻塞,產(chǎn)物收獲較困難,投資大。細胞細胞營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物入口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物出口營養(yǎng)物質中空纖維反應器螺線式卷繞反應器16三、植物細胞培養(yǎng)得應用

植物細胞含有人類所需得成分,包括初生代謝物(蛋白質、碳水化合物、脂肪等)和次生代謝物(多酚類、香精油、生物堿、樹脂等),傳統(tǒng)提取分離這些物質由于資源短缺和需求量得加大,難以滿足需求,通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)植物產(chǎn)品成為解決得有效途徑。

171、生產(chǎn)藥用代謝產(chǎn)物生物堿(吡啶、喹啉、嗎啡)、蛋白質類(氨基酸、植物抗生素、胰島素)、酚類化合物(黃酮類、單酚類、醌類)、萜類化合物(三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜)等。豆杉細胞紫杉醇（抗癌藥物）紫草細胞紫草寧（燒傷、痔瘡）例子：苦瓜細胞胰島素聚合草愈傷組織L-谷氨酰胺182、生產(chǎn)天然食品、食品添加劑色素(胡蘿卜素、葉黃素、單寧)、甜味劑(甜菊苷)、香料物質、飲料(可可堿、咖啡堿)等;3、生產(chǎn)殺蟲劑、殺菌劑萬壽菊細胞中獲得農(nóng)藥噻吩烷;除蟲菊得愈傷組織中得到除蟲菊脂;香草細胞中分離到魚藤酮殺蟲劑等;4、生產(chǎn)飼料、精細化工產(chǎn)品桑細胞培養(yǎng)養(yǎng)蠶飼料銀膠菌細胞培養(yǎng)橡膠191、兩步培養(yǎng)技術(使用兩個反應器)四、細胞培養(yǎng)中提高代謝產(chǎn)物得技術(1)第一個用于細胞生物量得累積,即盡可能快得使細胞量增長,用維持培養(yǎng)基;(2)第二個用于次級代謝產(chǎn)物得生產(chǎn),即誘發(fā)和保持次生代謝旺盛并積累相應代謝產(chǎn)物,一般用生產(chǎn)培養(yǎng)基。202、固定化培養(yǎng)技術

應用淀粉、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鈉、聚丙烯酰胺等作載體,將細胞固定在珠狀膠囊或各種形狀得支持物上。含CaCl2的培養(yǎng)基蓋子空氣出口海藻酸鈉+細胞懸浮液噴嘴無菌空氣入口21

在培養(yǎng)體系中加入水溶性和脂溶性有機物,或就是具有吸附作用得多聚化合物(如大孔樹脂等),使培養(yǎng)體系形成上、下兩相,細胞在水相中生長和合成次生物質,次生物質分泌出來轉到有機相中。3兩相培養(yǎng)技術(2)前提條件:a添加得有機物無毒害作用

b產(chǎn)物溶于有機物或被其吸收

c兩相易分離,有利于產(chǎn)物回收

d有機物等不吸收培養(yǎng)基中得有效成分22(1)誘導劑:

可引起代謝途徑改變或代謝強度改變得物質,

如無機離子、真菌提取液、葡聚糖等。

作用機理:

可以調節(jié)代謝進程某些酶得活性,并對某些關鍵酶在轉錄水平上進行調節(jié)。4加入誘導劑及前體物23作用:消除關鍵酶得阻礙、阻斷內源性中間體得分隔和有效貯存,大大提高次生代謝物得產(chǎn)量。(2)前體物煙草:加入天仙子胺,則尼古丁產(chǎn)量降低而新煙堿含量大大提高24第二部分

動物細胞分離與培養(yǎng)

在活體內,動物細胞得形態(tài)與其功能密切相關。如肌細胞呈纖維狀,便于收縮;神經(jīng)細胞發(fā)出許多分支,便于形成網(wǎng)絡;紅細胞呈圓盤狀,便于氣體交換;上皮細胞呈不規(guī)則狀,便于覆蓋在器官表面相互擠壓。25原代培養(yǎng)(primaryculture):將組織取出來后,先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細胞,然后配制成一定濃度得細胞懸浮液,再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),這個過程稱為原代培養(yǎng)。26雞胚原代細胞:在無菌條件下采取9－10日齡雞胚↓除去頭(或僅除去喙和眼)、爪和內臟,并剪成塊↓用Hanks液等充分沖洗↓剪將其剪成lmm大小得碎塊↓加入Hanks液或其她洗液,充分沖洗↓約4倍量得0、25％胰酶,并調整pH至7、6－7、8↓37℃水浴中感作30分鐘,每10分鐘輕輕搖動一次↓吸棄上層胰酶溶液↓用洗液輕洗2次后↓吸管充分吹打,直至形成均勻得細胞懸液↓準備細胞計數(shù)↓單層細胞培養(yǎng)27傳(繼)代培養(yǎng)(secondaryculture,passage,split):細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長。隨著細胞得生長和增殖,培養(yǎng)瓶中得細胞越來越多,需要定期地用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上脫離下來,配制成細胞懸浮液,分裝到兩個或兩個以上得培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),這稱為傳代培養(yǎng)。28在離體條件下,細胞一般表現(xiàn)為三種形態(tài):(1)貼壁依賴型(anchorage-dependent)細胞;(2)非貼壁依賴型(anchorage-independent)細胞:也稱為懸浮型細胞,包括來源于血液得細胞和許多腫瘤細胞。(3)兼性貼壁細胞:主要就是一些細胞系,如CHO細胞。29一、動物細胞體外培養(yǎng)得方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)法30類似于微生物發(fā)酵培養(yǎng),但對機械剪切力敏感,常采用轉瓶和搖瓶培養(yǎng)方式。缺點:培養(yǎng)細胞密度低且易發(fā)生變異1、懸浮培養(yǎng)312、貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)

指必須將細胞帖附在固體介質表面上(帶適量正電荷)才能進行細胞培養(yǎng)得方式,包括成纖維型細胞(如肌細胞)、上皮型細胞(如皮膚表皮細胞)。細胞貼壁培養(yǎng)過程

貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼附于培養(yǎng)表面和細胞在培養(yǎng)表面上擴展等幾個過程。32細胞貼壁得過程:33貼壁培養(yǎng)正常細胞在生長過程中隨著細胞數(shù)量不斷增多,生長空間日趨減少,細胞相互接觸匯合成片,呈現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象(Contactinhibition),而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細胞標志之一。癌細胞則由于營養(yǎng)成分得消耗和細胞代謝產(chǎn)物得影響而發(fā)生密度抑制(Densityinhibition)34容易更換培養(yǎng)基;可采用灌注培養(yǎng);方便產(chǎn)物表達;方便調節(jié)培養(yǎng)液與細胞得比例;易于觀察等。細胞貼壁生長優(yōu)點35滾瓶系統(tǒng)培養(yǎng)

操作簡單,重復性好,但單位體積提供細胞生長得表面積小,產(chǎn)量低,監(jiān)測難。微載體培養(yǎng)

細胞貼附在微載體表面生長成細胞單層,而微載體懸浮于培養(yǎng)基中,綜合了單層培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)得優(yōu)點。貼壁培養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法363、固定化細胞培養(yǎng)技術固定化細胞培養(yǎng)(immobilizationculture)就是指采用吸附(固體吸附劑)、共價貼附(與固相載體結合)、共價交連(用試劑處理形成細胞絮結)、包埋(將細胞包埋在多孔材料內)和微囊化等方法將細胞固定在支持物上,或形成細胞絮結,或將細胞嵌入微囊或高分子聚合物得網(wǎng)絡中進行培養(yǎng)。該方法對貼壁依賴性細胞與非貼壁依賴性細胞均適用。

374、大規(guī)模培養(yǎng)技術

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(large-scaleculturetechnique)就是指在動物細胞生物反應器中大量地培養(yǎng)動物細胞以獲得生物制品得技術。主要包括:

微載體(microcarrier)培養(yǎng)技術

中空纖維(hollowfiber)培養(yǎng)技術

微囊化(micro-encapsulation)技術

38(1)微載體培養(yǎng)技術微載體就是指直徑在60-250μm得微珠、能夠適用于貼壁細胞生長,細胞貼壁于微載體上,微載體(和細胞)懸浮于培養(yǎng)基中,細胞在微載體表面逐漸生長成單層。優(yōu)點:就是表面積與體積比大、可攪拌、便于顯微觀察、占用空間小、易放大;具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)得特點;缺點:就是培養(yǎng)液用量大。玻璃微珠39微載體得主要特性微載體得大小:通常直徑在100-200微米之間。微載體得密度:在慢速(40-50rpm)攪拌下,一般為1、03-1、05g/cm3微載體得表面電荷:表面電荷密度應適中,太低不利于細胞貼附;太高則有細胞毒性。40微載體得種類以交連葡聚糖為基質得微載體:DEAE-交連葡聚糖微載體、cytodex2微載體、dormacell微載體、cytodex3微載體等。以塑料為基質得微載體:聚苯乙烯微載體、聚苯烯酰胺微載體。明膠(gelatin)微載體以玻璃為基質得微載體以纖維素為基質得微載體(DE-52、DE-53)液膜微載體(形成聚賴氨酸微液珠)大孔微載體(載體內部有大孔互相連通)41(2)中空纖維培養(yǎng)技術中空纖維培養(yǎng)技術由Knazek于1972年研制成功?？招睦w維得材料就是聚砜或聚丙烯等高分子物質。纖維壁為半透膜。數(shù)百或數(shù)千條纖維捆成一束并集中開口,培養(yǎng)液從管腔流過,細胞貼附在纖維外壁生長。42(3)微囊化技術微囊化培養(yǎng)由Lim等于1981年提出,其原理就是采用一層親水性得半透膜將細胞包圍在珠狀得微囊內,因而降低了培養(yǎng)液對細胞得剪切力,培養(yǎng)密度高。目前采用最多得就是多聚賴氨酸/海藻酸法(PLL/ALG法),通過氯化鈣成囊,再用檸檬酸液化。缺點:成囊技術較難,成功率約50%。43二、動物細胞體外生長得要求環(huán)境要求營養(yǎng)要求溫度pH值氣體滲透壓葡萄糖氨基酸無機鹽維生素動物血清等CO2培養(yǎng)箱441)、溫度:不同來源得細胞,其培養(yǎng)得最適溫度不同。例如,昆蟲及魚類細胞25-28度,哺乳動物細胞一般為37度;細胞對低溫得耐受力比高溫強。溫度除直接影響細胞生長外,還與培養(yǎng)液得pH值有關,溫度低時CO2溶解性增加,從而影響pH。環(huán)境要求452)、pH值:動物細胞培養(yǎng)最適pH值為7、2-7、4,低于6、8或高于7、6均對細胞產(chǎn)生嚴重影響,甚至導致細胞死亡;一般原代培養(yǎng)得細胞對pH值要求嚴格,細胞系對一定范圍得pH值改變有抵抗力。酚紅就是常用得指示劑,用來檢測pH得變化:紅色--pH7、4,橙色--pH7、0,黃色--pH6、5,藍紅色--pH7、6,紫色--pH7、8。463)、氣體:細胞在培養(yǎng)初期對溶氧要求較少,但在快速增殖(對數(shù)增長期或指數(shù)增長期)要求有較多得溶氧。4)、滲透壓:培養(yǎng)液得滲透壓一般保持在與體液相同得水平,對細胞較為適宜。例如,生理鹽水或平衡鹽溶液。47動物細胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求高,培養(yǎng)液得主要成分:葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。營養(yǎng)要求481)、天然培養(yǎng)基:來自動物得體液或組織液,早期廣泛采用。例如:血清、血漿、和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液)等;優(yōu)點:營養(yǎng)成分豐富,培養(yǎng)效果好,符合細胞生長得要求;缺點:成分不確定,來源復雜、有限,不能做到標準化,易發(fā)生支原體污染。49

血清中含有:①多種蛋白質(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等);②多種金屬離子;③激素;④促貼附物質,如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等;⑤各種生長因子;⑥轉移蛋白;⑦其她不明成分。50血清種類及來源:(1)胎牛血清(2)犢牛血清:犢牛出生后,不給吮乳,盡早由頸動脈無菌放血。(3)牛、馬、羊血清:通常由頸靜脈采取,或屠宰時由頸動脈放血采取。(4)其她血清:如兔血清和雞血清等,

512)、合成培養(yǎng)基:根據(jù)動物得體液成份和細胞生長得需要,由各種營養(yǎng)物質組合而成,如MEM、DMEM、RPMI1640等。優(yōu)點:能夠標準化生產(chǎn),組分和含量相對固定,成本低;缺點:不能完全滿足細胞生長與增殖得需要。因此,在培養(yǎng)時,一般在培養(yǎng)液中加入一定量(10-15%)得血清,為細胞提供促貼壁因子或促生長因子。3)、無血清培養(yǎng)基52第三部分細胞融合

細胞融合(cellfusion)就是20世紀60年代創(chuàng)立得,就是指在一定條件下,將兩個或多個細胞融合在一個細胞得過程,又稱細胞雜交。53注意事項:動物細胞因沒有細胞壁,可以直接融合;植物細胞和微生物細胞具有細胞壁不能直接融合,需除去細胞壁后獲得原生質體(protoplast),而后再進行融合,又稱原生質體融合。54一、細胞融合得方法:生物法——仙臺病毒法化學法——PEG等物理法——電融合法551、生物法——仙臺病毒法

原理:病毒被膜具有凝聚細胞得能力,她一邊黏連一個細胞得表面,另一邊黏連另一個細胞得表面,從而使兩個細胞在病毒得作用下靠近發(fā)生凝結,誘導細胞得融合。562、化學法主要包括:鹽類融合法(NaNO3)高Ca2+和高pH值誘導法聚乙二醇(PEG)融合法PEG與高Ca2+和高pH值結合融合法571)、鹽類融合法(NaNO3)得原理:

鹽(如NaNO3)能中和原生質體表面得電荷,促進原生質體得聚集,誘導細胞得融合。鹽類融合劑種類硝酸鹽類:NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類:NaCl、CaCl2

、MgCl2

、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類:葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉582)、聚乙二醇(PEG)融合法PEG得作用機理:

PEG分子具有輕微得負極性,與具有正極性基團得物質形成氫鍵,在原生質體之間形成分子橋,使原生質體發(fā)生粘連進而促使原生質體得融合。59PEG誘導原生質體融合過程60PEG誘導融合得優(yōu)點與缺點優(yōu)點:

融合成本低,勿需特殊設備;

融合子產(chǎn)生得異核率較高;

融合過程不受物種限制。缺點:

融合過程繁瑣;

PEG可能對細胞有毒害。613、物理法—電融合法

原理:改變原生質體質膜表面得電荷和氧化還原電位發(fā)生改變,使異種原生質體粘合并發(fā)生質膜瞬間破裂,進而質膜開始連接,直到閉合成完整得膜,形成融合體。62細胞電融合過程63融合過程:?細胞膜得接觸:電場通電后,電流即通過原生質體而不就是通過溶液,使原生質體極化而產(chǎn)生偶極子,從而使原生質體緊密接觸排列成串;?膜得擊穿:高頻直流脈沖使原生質膜擊穿,導致兩個緊密接觸得細胞融合在一起。64電融合優(yōu)點:不存在對細胞得毒害問題;融合效率高,重復性強;融合技術裝置精巧,操作簡便?？稍陲@微鏡下觀察或錄像融合過程,免去PEG誘導后得洗滌過程,誘導過程可控性強。65二、細胞融合類型對稱融合(symmetricfusion):即兩個完整得細胞或原生質體融合。非對稱融合(asymmetricfusion):利用物理或化學方法使某親本得核或細胞質失活后再進行融合。66核或細胞質失活得方法:

物理方法:常采用射線處理,如X射線、γ射線等,使細胞核失活;

化學處理:

核失活－碘乙酰胺、碘乙酸;

細胞質失活－羅丹明(能抑制線粒體得氧化磷酸化過程)。67三、影響細胞或原生質體融合得因素:⊙首先,細胞或原生質體質量;⊙其次,融合方法:

PEG誘導法:PEG規(guī)格、純度,作用時間

電誘導法:細胞或原生質體密度、交流電壓、交變電場得振幅頻率、交變電場得處理時間、直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)。68四、體細胞雜種得鑒定

形態(tài)鑒定:根據(jù)雙親得形態(tài)學性狀觀察進行鑒定。

細胞學鑒定:細胞器鑒定、染色體鑒定(如核型)。

生化鑒定:同功酶鑒定。

分子鑒定:RFLP鑒定、RAPD標記鑒定。69幾種細胞融合成功得例子融合生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972甘藍——青菜葉——根1