基因組學(xué)物理圖繪制

基因組學(xué)物理圖繪制物理作圖得方法限制酶作圖(RestrictionMapping)依靠克隆得基因組作圖(clone-basedmapping)熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)序列標(biāo)簽位點作圖(STS,Sequencetagedsite)1、限制性作圖

她就是將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子得相對位置、其只能應(yīng)用于較小得DNA分子,其上限取決于作圖分子中限制酶位點得頻率、通常采用得6堿基對識別順序得限制酶僅適合50Kb以下DNA分子得精確作圖、1、1限制酶作圖(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待檢得DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH瓊脂糖電泳用于小片段DNA得分析,精度非常高聚丙烯酰胺凝膠電泳1、2限制酶作圖得改進(jìn)脈沖凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切點限制圖繪制垂直交變電場,兩個電場方向成為直角一般得凝膠電泳30Kb以下,脈沖凝膠就是提高了2個數(shù)量級,達(dá)到10MbDNA片段>50Kb稀有切點限制圖繪制注意事項:

識別序列越長產(chǎn)生得片段越大;識別位點堿基數(shù)預(yù)計DNA片段平均長度/Kb41648641010004得n次方,n就是限制酶識別得堿基數(shù)識別位點堿基得組成影響限制性片段得大小;如人類基因組A/T比例接近60/%,選用高比例A/T位點限制酶,產(chǎn)生得片段多于高比例G/C識別位點酶特異序列含量高,否則效果不好大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點有些限制酶識別位點較長如酵母得Ⅰ-SceI識別順序為18bp,TAGGGATAA/CAGGGTAAT如果高等真核生物基因組中無此序列,可通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座和噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)得方法將其引入待測基因組中、基因組DNA得甲基化狀態(tài)如人類活細(xì)胞基因組中大量5’-CG-3’順序得胞嘧啶被甲基化,形成5’-TG-3’,使許多含有5’-CG-3’順序得內(nèi)切酶很少找到可切位點、SmaICCC/GGG78kbNotIGC/GCGCGC1Mb凝膠濃度、電場強度、緩沖液采用定時改變電場方向得交變電源,每次電流方向改變后持續(xù)1s到5min左右,然后再改變電流方向,反復(fù)循環(huán),所以稱之為脈沖式交變電場。脈沖凝膠電泳(PFGE)(pulsed-fieldgelelectrophoresis)分離范圍:分子量20kb—5000kb分辨力:10MB垂直交變電場,兩個電場方向成為直角30Kb10MbDNA片段>50Kb1984年,Schwartz和Centor發(fā)明了交變脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)技術(shù),與常規(guī)得直流單向電場凝膠電泳不同,這項技術(shù)采用定時改變電場方向得交變電源,每次電流方向改變后持續(xù)1s到5min左右,然后再改變電流方向,反復(fù)循環(huán),所以稱之為脈沖式交變電場。

一、PFGE得基本原理

脈沖電泳分離DNA大分子得介質(zhì)就是瓊脂糖,大于20kb得線性DNA雙鏈片段,在瓊脂糖凝膠得網(wǎng)孔中得泳動,就像蛇行似得尋找彎曲蜿蜒得孔隙。普通得單方向恒定電場給DNA分子得泳動動力方向確定且不發(fā)生變化,所以嚴(yán)重影響凝膠電泳分離大分子量DNA片段得效果。

PFGE施加在凝膠上至少有兩個電場方向,時間與電流大小也交替改變,使得DNA分子能夠不斷地調(diào)整泳動方向,以適應(yīng)凝膠中不規(guī)則得孔隙變化,達(dá)到分離大分子線性DNA得目得,最大分辨率為5000kb大小得線性DNA分子。在交變脈沖電場中,大分子量線性DNA改變泳動方向所需時間比小分子線性DNA要長,因為前者變形能力低于后者。當(dāng)某一線性DNA在脈沖場中改變形狀調(diào)整方向進(jìn)行遷移所需得時間大于脈沖場脈沖維持時間時,該DNA得遷移速度將減為最低。線性分子改變形狀和泳動方向所需時間與其分子量大致成正比,PFGE也就是基于不同DNA分子量得差異作為分離不同DNA分子得依據(jù)。當(dāng)DNA分子變形轉(zhuǎn)向所需時間與脈沖時間較接近時,遷移率與DNA分子量成反比。根據(jù)被分離DNA分子得范圍選擇適當(dāng)?shù)妹}沖時間,經(jīng)過較長時間不斷變形轉(zhuǎn)向泳動,不同大小得DNA就被分離。DNA分子得凈遷移方向與普通電泳一樣,垂直于樣品孔。

影響PFGE分辨率得因素包括幾方面:兩個脈沖場得均一性;兩個脈沖場得脈沖時間以及她們之間得比率;兩個脈沖場得強度和方向。為了增強PFGE對大小差異較大得DNA樣品得分辨率,可采用交變脈沖梯度電場,即在電泳過程中,先用較短得交變脈沖時間使較小得DNA分子分離,然后用較長得交變脈沖時間分離較大得DNA分子。端粒自主復(fù)制起始點標(biāo)記基因標(biāo)記基因著絲粒大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制起始點質(zhì)粒擴增篩選標(biāo)記2、1大片段DNA得克隆載體克隆位點YAC插入子穩(wěn)定性問題,同一酵母細(xì)胞中多個YAC引起交換產(chǎn)生嵌合順序PBR322人工改造而來色氨酸、鳥苷酸篩選,TRP和URAnium,基本培養(yǎng)基上篩選就是否有這兩個臂得基因。SUP確定就是否有插入片段,插入時,紅色克隆,無克隆時顯示白色11、4kb著絲粒負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂時染色體均等分配端粒:保持人工染色體得穩(wěn)定性。自主復(fù)制起點:細(xì)胞染色體復(fù)制得啟動缺點插入子不穩(wěn)定交換效應(yīng)GC區(qū)克隆效率低標(biāo)準(zhǔn)得YAC操作程序克隆得DNA平均為600kb,改進(jìn)得程序可獲得1400kb230kb-1700kb標(biāo)準(zhǔn)操作為600kb,改進(jìn)得1400kb插入子不穩(wěn)定交換效應(yīng)嵌合序列GC區(qū)克隆效率低人類基因組中BAC:細(xì)菌人工染色體300Kb1992與一般質(zhì)粒有2點不同:單拷貝復(fù)制(不會發(fā)生重組嵌合)相對分子量大(具有較大容量)介導(dǎo)F因子單向復(fù)制維持低水平質(zhì)?？截悢?shù)BAC來源于大腸桿菌中得天然F質(zhì)粒,與一般質(zhì)粒有2點不同:單拷貝復(fù)制(不會發(fā)生重組嵌合),相對分子量大(具有較大容量),類似于制備質(zhì)粒方法提取質(zhì)粒,方便快捷Cm氯霉素Loxp蛋白作用位點,可將環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性DNA,p1Cre蛋白作用位點CosN伽馬噬菌體末端酶專一性切割位點2、2重疊群組建重疊群:相互重疊得DNA片段組成得物理圖、重疊群得組建方法染色體步移法指紋:系指確定DNA樣品所具有得DNA片段;一個克隆得指紋表示了該克隆所具有得限定得順序特征、2、3指紋作圖法常用得指紋分析方法:A限制性帶型(restrictionpatterns)指紋B重復(fù)序列DNA指紋(repetitiveDNAfingerprints)Southern

印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段得凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段得膜常用得指紋分析方法:C重復(fù)DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重復(fù)序列PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指紋DSTS作圖(STScontentmapping)AluPCR方法特點在于利用人DNA中普遍存在得Alu重復(fù)序列,這種300bp序列得拷貝約900、000個,分布于整個人基因組。雖然Alu重復(fù)序列各拷貝間有很大差別,但已確定出了一個相同序列,且重復(fù)子中一些區(qū)域就是極為保守得。我們認(rèn)為,可設(shè)計合適得能識別這些保守區(qū)得PCR引物,進(jìn)行有效得內(nèi)-Alu擴增,從復(fù)雜源中分離人DNA。平均密度4kb3、熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)將探針用熒光標(biāo)記,與細(xì)胞分裂中期得染色體雜交,用熒光顯微鏡觀察信號所處得位置,將探針標(biāo)定在連鎖圖上。分辨率低,敏感性低精細(xì)作圖對于特定探針,原位雜交所顯示得中期染色體熒光信號所處得位置與染色體短臂末端得相對距離不變,經(jīng)標(biāo)記可將其標(biāo)定在連鎖圖上、分辨力達(dá)到25Kb,染色體無法確定外部形態(tài)限制性作圖快速,但就是不適合大基因組克隆重疊群構(gòu)建程序復(fù)雜,費時費力指紋作圖對于大基因組有不少問題,會出現(xiàn)誤排原位雜交操作困難,資料積累慢,一次實驗定位得分子標(biāo)記3-4個,4、序列標(biāo)簽位點作圖(STS,SequenceTagedSite)長度:100-500bp序列已知,可以設(shè)計PCR反應(yīng)單拷貝,在染色體上得位置就是唯一得EST(Expressedsequencetag)大部分可