合成基因（或蛋白質(zhì)）網(wǎng)絡學習資料

合成基因（或蛋白質(zhì)）網(wǎng)絡Syntheticgene/proteinnetwork李琬生物物理教研室分子生物學館212liwan@合成基因網(wǎng)絡通過化學合成、基因工程和生物工程等手段，將人工設計合成的基因連接成網(wǎng)絡，并在細胞中表達各種人為設計的信號分子，將所表達的各種信息按要求傳遞，相互調(diào)控信號途徑。具有廣泛的應用前景。合成基因（或蛋白質(zhì)）線路合成基因（或蛋白質(zhì)）網(wǎng)絡定向進化基因線路與網(wǎng)絡合成基因線路與網(wǎng)絡的應用△※△※△合成基因（或蛋白質(zhì)）線路（circuit）遺傳線路，俗稱基因線路借鑒電磁學中電器件關系線路的描述方法由各種調(diào)節(jié)元件和被調(diào)節(jié)的基因組合而成的遺傳裝置，可以在特定條件下定時定量地調(diào)控表達基因產(chǎn)物。邏輯基因線路功能基因線路△△※邏輯基因線路

（logicgenecircuit）起源于數(shù)字電路中邏輯運算的思想借鑒控制理論和邏輯電路的設計規(guī)則研究基因線路的邏輯關系與調(diào)控方法。模擬各種數(shù)字元件的功能，研究基因線路中的噪聲傳播和相應機制等?！鳌?）邏輯門（2）遺傳撥動開關（3）遺傳振蕩器（4）可存儲基因模塊（1）邏輯門（Logicgates）數(shù)字電子線路的基本內(nèi)容最基本的運算單元執(zhí)行邏輯運算AND門RNA聚合酶

與啟動子結合的

親和力很低，基礎

轉錄相對較小激活因子親和力較低，無法與操縱子

結合激活因子誘導物改變構象與操縱子結合幫助RNAp與啟動子結合異丙基-β-D硫代半乳糖苷脫水四環(huán)素帶有記憶功能（memory）的AND門由于表達產(chǎn)生的CI始終能夠抑制LacI和TetR的產(chǎn)生，因此，體系將始終維持上述狀態(tài)，與誘導劑濃度無關。OR門（2）遺傳撥動開關(slideswitch)雙穩(wěn)態(tài)開關振蕩電壓、電流或其他電量的幅度隨時間而反復變化的物理現(xiàn)象。這種變化通常是周期性的。（3）遺傳振蕩器(Repressilator)基因振蕩一種基因調(diào)控機制生物生理節(jié)奏源于其自身細胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)濃度的周期性變化，由振蕩的幅度和周期來決定基因表達的時間基因水平的振蕩器對于調(diào)節(jié)細胞周期、生理節(jié)奏等細胞學行為起著非常關鍵的作用。將三個表達產(chǎn)物相互抑制的基因串聯(lián)成一個環(huán)狀結構，利用基因之間的抑制和去抑制效應就可以實現(xiàn)遺傳振蕩器的構建。SynthesizingANDgategeneticcircuitsbasedonCRISPR-Cas9foridentificationofbladdercancercellsCRISPR-Cas9細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9通過具有引導作用的sgRNA（shortguideRNA）靶向修飾基因。bladdercancercells功能基因線路(functiongenecircuit)利用基因模塊原有的功能，設計全新的遺傳線路，使生物系統(tǒng)具有特定的期望功能?！鳎?）無細胞合成功能基因線路（2）控制群體數(shù)量的功能基因線路（3）控制圖案形成的功能基因線路（1）無細胞(cell-free)合成功能基因線路核糖核酸內(nèi)切酶單鏈DNA調(diào)控基因表達不需要細胞因子的介入，即沒有蛋白質(zhì)的參與?；蛟S生命（或蛋白質(zhì)）的誕生就是利用這種基因線路來實現(xiàn)的。利用該功能基因線路，可以人為地設計合成需要的各種蛋白質(zhì)。教學大綱掌握：控制群體數(shù)量的功能基因線路，控制圖案形成的功能基因線路，合成轉錄后基因網(wǎng)絡，合成跨細胞基因網(wǎng)絡了解：合成基因（或蛋白質(zhì)）網(wǎng)絡步驟，合成轉錄基因網(wǎng)絡，合成信號轉導網(wǎng)絡，合成生理信號響應系統(tǒng)，合成生物學與基因表達的進化，合成基因線路與網(wǎng)絡的重構、工程化，組合合成與基因網(wǎng)絡的定向進化，工程化基因網(wǎng)絡的機遇與挑戰(zhàn)（2）控制群體數(shù)量（populationcontrol）的功能基因線路細胞增長細胞凋亡（apoptosis）信號分子當信號分子濃度達到或超過閾值后，LuxR與AHL結合，并啟動啟動子PluxI融合基因檢測融合蛋白的表達量引起細胞凋亡整個系統(tǒng)中，隨著細胞濃度的增加，環(huán)境中的信號分子濃度也增加。信號分子的濃度越高，CcdB基因的表達量越多，凋亡細胞的數(shù)量就越多。當細胞的增長與凋亡達到一個動態(tài)平衡時，群體數(shù)量進入一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。細胞密度此環(huán)境下可能達到的最大細胞密度CcdB蛋白的濃度細胞生長速率常數(shù)細胞死亡速率常數(shù)信號分子AHL的濃度CcdB生成速率常數(shù)CcdB降解速率常數(shù)AHL生成速率常數(shù)AHL降解速率常數(shù)細胞自然生長的logistic模型細胞凋亡的速率

穩(wěn)定狀態(tài)下（3）控制圖案形成（patternformation）的功能基因線路既存在于單個細胞也存在于多細胞組織的協(xié)調(diào)細胞行為的標志性行為。包括細胞與細胞間的通訊交流細胞內(nèi)的信號作用過程利用遺傳線路對信號濃度距離變化產(chǎn)生的響應，構建細胞群體圖案系統(tǒng)。距離近，過高濃度的AHL過表達CI蛋白和LacIM1蛋白，LacIM1蛋白抑制熒光蛋白的啟動子距離適當，適量的AHL引起適量的CI蛋白和LacIM1蛋白的表達。CI對下游啟動子的抑制作用使lacI基本不表達，LacIM1基因表達的量不足以抑制下游熒光蛋白的啟動子距離遠，過少的AHL無法開啟足量的CI蛋白和LacIm1蛋白，無法抑制下游基因，使lacI基因表達，產(chǎn)生的LacI蛋白抑制熒光蛋白的表達能夠穿過細胞膜，濃度向周圍成梯度下降不同熒光細胞在多個區(qū)域放置多個信號發(fā)生細胞兩個信號細胞，濃度不一致兩個信號細胞三個信號細胞四個高濃度信號細胞Model-guidedquantitativeanalysisofmicroRNA-mediatedregulationoncompetingendogenousRNAsusingasyntheticgenecircuit只有沒被miRNA結合的mRNA才能翻譯成蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)的濃度與mRNA的濃度成正比。Therefore,thedifferencebetweentheproteinlevelswithorwithoutthecompetingRNAregulationindicatesthestrengthoftheceRNAeffect.紅外熒光蛋白藍色熒光蛋白紅色熒光蛋白黃色熒光蛋白TherangeandstrengthofceRNAregulationarelargelydeterminedbytherelativeabundanceandthebindingstrengthofmiRNAandceRNAs.合成基因（或蛋白質(zhì)）網(wǎng)絡轉錄轉錄后修飾翻譯翻譯后修飾步驟合成轉錄基因網(wǎng)絡合成轉錄后基因網(wǎng)絡合成信號轉導網(wǎng)絡生理信號響應系統(tǒng)合成跨細胞基因網(wǎng)絡※△步驟使基因網(wǎng)絡概念化，并產(chǎn)生相應的功能抽提要求的生物功能，并利用簡單的邏輯網(wǎng)絡建模從物理DNA片段庫中為線路設計尋找更為合適的遺傳裝置構建基因網(wǎng)絡反復加強設計，使基因線路發(fā)揮功能通過實驗驗證所設計的模型合成轉錄基因網(wǎng)絡（transcriptionalgenenetwork）aTc信號解除對啟動子的抑制三階轉錄級聯(lián)線路通過修飾啟動子區(qū)域控制基因的轉錄改變轉錄因子的親和力操縱子（operon）luxlac阻尼振蕩氮調(diào)節(jié)子INRI~P達到最大值時激活glnKp自然界控制系統(tǒng)由多個正負反饋回路構成彼此交聯(lián)嵌套誘導反義RNA的表達形成無法翻譯的雙鏈mRNA及mRNA的降解siRNA（SmallinterferingRNA）技術沉默基因表達合成轉錄后基因網(wǎng)絡（post-transcriptionalgenenetwork）※四環(huán)素紅霉素報告基因，人胎盤分泌堿性磷酸酶入入通過四環(huán)素（

tetracycline）的加入，或者通過紅霉素撤銷產(chǎn)生的轉錄后水平上的mRNA報告基因沉默，最終實現(xiàn)在轉錄后水平上對SEAP的調(diào)控。在翻譯水平上構建基因網(wǎng)絡。核糖體組裝的翻譯起始因子4G的切割突變體雷帕霉素熒光素酶基因在轉錄水平上通過四環(huán)素的加入，關閉eIF4G融合蛋白的表達來實現(xiàn)可控?；蛘呤窃诜g水平通過雷帕霉素的加入產(chǎn)生功能eIF4G來進行可控。合成信號轉導網(wǎng)絡（signaltransductionnetwork）信號轉導細胞表面受體配體識別細胞質(zhì)信使信號加工細胞核轉錄元件調(diào)控基因表達細胞外配體結合到細胞表面受體分子上激活下游轉錄因子激活的轉錄因子自身表達水平上調(diào)細胞表面受體的表達水平上調(diào)生理信號響應系統(tǒng)為了實現(xiàn)對某些疾病治療的目標，設計能夠?qū)ν庠葱盘柡蛢?nèi)源生理信號均產(chǎn)生響應的基因網(wǎng)絡是非常必要的。對病理信號響應產(chǎn)生治療結果通過外源調(diào)節(jié)進行修正正常含氧條件下缺氧條件下原始霉素報告基因，分泌型淀粉酶組織缺氧誘導因子△細胞間通訊與細胞內(nèi)信號加工合成跨細胞(trans-cellular)基因網(wǎng)絡人類胚腎細胞中國倉鼠卵巢細胞處于同一氣體氛圍人生物素酶醇脫氫酶定向進化基因線路與網(wǎng)絡合成生物學與基因表達的進化合成基因線路與網(wǎng)絡的重構、工程化組合合成與基因網(wǎng)絡的定向進化工程化基因網(wǎng)絡的機遇與挑戰(zhàn)合成生物學與基因表達的進化生物學表型的進化通常依賴于基因表達的變化，而不是編碼蛋白質(zhì)序列的變化基因表達是由相互作用的調(diào)控因子構成的網(wǎng)絡來調(diào)控的。合成生物學——進化——優(yōu)化功能生物學過程與功能是如何起源于純粹的物理和化學過程的進化理論的一個基本預測在一個既定環(huán)境的進化過程中，蛋白質(zhì)表達水平自身優(yōu)化達到對環(huán)境的最大限度的適應。適應性與蛋白質(zhì)表達水平的關系很難確定。合成生物學使研究者能夠設計簡單的遺傳線路在該線路中，感興趣的蛋白質(zhì)表達水平能夠通過精確調(diào)節(jié)以測定生物體在蛋白質(zhì)表達水平上的適應性。大腸桿菌中表達lac操縱子（編碼lacZ和lacY）好處：在乳糖代謝過程中提供能量和碳源；花費：LacZ和LacY表達的代謝負擔。對于環(huán)境中一個既定的乳糖濃度，存在一個最優(yōu)的lac操縱子表達量。在不同乳糖環(huán)境中的實驗室進化發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌能夠?qū)ac操縱子的表達水平進化到一個既定的濃度。生命體面臨生存環(huán)境的多重挑戰(zhàn)波動的營養(yǎng)來源、大量的壓力條件，以及與其他生物潛在的有毒相互作用等。代謝的遺傳調(diào)節(jié)的目標——使生存最大化大腸桿菌在甘油中生長，根據(jù)虛擬模型的預測，觀察到基因表達進化使生長速率最大化。其他選擇壓力——其他功能方面優(yōu)化枯草芽孢桿菌刪除突變體比野生型生長迅速。儲備了大量的資源，以期對即將變化的環(huán)境產(chǎn)生響應。這些發(fā)育途徑在饑餓條件下激活，而在營養(yǎng)充足的條件下抑制?；虮磉_是一個資源豐富條件下快速生長和對環(huán)境變化預期的折衷。遠古蛋白的序列進化樹和統(tǒng)計學對一個現(xiàn)代家族蛋白推導所得由化學合成所得，并在細胞中表達或體外研究合成的策略重新構建一些古代基因表達圖譜合成基因線路與網(wǎng)絡的重構、工程化(engineering)利用遺傳元件工程化細胞中復雜行為。利用細菌檢測預先設定圖像的邊緣處于暗環(huán)境的細菌產(chǎn)生一個可擴散的化學信號AHLPCB磷?；挥袑D像光區(qū)域和擴散信號敏感的細菌，能夠產(chǎn)生色素，作為邊緣圖像的輸出。細胞的適應性和表型對重構的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的響應。特定的重構菌株比野生菌株具有更強的生長能力。生命體能夠通過調(diào)控網(wǎng)絡的微小變化來實現(xiàn)進化；網(wǎng)絡的差異在很大程度上是能夠忍受的。合成生物學DNA的物理合成與組裝新的基因、基因組及基因網(wǎng)絡完整的染色體和基因組生活方式策略營養(yǎng)的獲得海洋細菌生長最優(yōu)化營養(yǎng)豐富營養(yǎng)貧乏工程化的支架蛋白利用工程化的合成支架蛋白作為空間上區(qū)域化的信號節(jié)點，將基于支架蛋白的反應整合在一起，得到完全依賴于蛋白質(zhì)相互作用的、可重新配置的人工信號通路。細胞中，構成通路的信號蛋白分子通常由支架物蛋白物理地組裝成聯(lián)合體，通過支架來定向信息流，提高匹配蛋白的信號傳遞，同時通過輔助蛋白激酶和磷酸酶與它各自的底物結合而起作用，保證信號傳遞的特異性和高效性。支架聯(lián)合體作為反饋回路的集散中心承擔著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和實現(xiàn)蛋白質(zhì)重新組裝的作用，對信號通路動態(tài)響應行為進行調(diào)節(jié)。因此，支架蛋白對于通路響應的動態(tài)行為至關重要。這種工程化策略讓支架蛋白成為一個靈活的平臺，利用支架蛋白在空間上的局域化作用建立精細的微觀結構，在誘導信號的調(diào)控下重新配置信號通路，實現(xiàn)期望的時序和動力學行為。組合合成與基因網(wǎng)絡的定向進化（directedevolution）基因網(wǎng)絡連接庫通過特定位點變換不同的元件，創(chuàng)造元件間的連接庫，而同時維持整體網(wǎng)絡骨架的完整性。構建策略通過對庫的篩選，產(chǎn)生邏輯線路。研究策略對組合合成網(wǎng)絡逐個篩選。對邏輯門的研究發(fā)現(xiàn)，一些突變能夠?qū)⑤斎胗葾ND轉變?yōu)镺R研究表明，具有同樣拓撲學的網(wǎng)絡可能具有不同的功能，而具有相似行為的網(wǎng)絡可能具有不同的拓撲特征。在適當?shù)臈l件下，合成基因網(wǎng)絡可以通過進化來很好地調(diào)整其結構。E.coli轉錄啟動子的重構研究網(wǎng)絡能夠耐受新的鏈接對標準元件庫的合成與篩選將啟動子區(qū)域隨機化，產(chǎn)生具有不同轉錄水平的啟動子，接著利用計算機模型篩選哪一個啟動子突變體可用來設計合成基因網(wǎng)絡。通過多樣性的產(chǎn)生與篩選獲得需要的基因功能，可以用來合理設計與優(yōu)化基因線路，并且用于基因組規(guī)模上的操作。在大腸桿菌單一細胞或群體中的染色體上引入DNA的錯配、插入和刪除等，使該過程自動化，用于大腸桿菌工程菌種的進化，生產(chǎn)蕃茄紅素。工程化基因網(wǎng)絡的機遇與挑戰(zhàn)

（opportunitiesandchallenges）載體轉化系統(tǒng)質(zhì)量控制分析T7噬菌體大腸桿菌替代細菌限制特定模塊的獲得代謝負擔合成基因網(wǎng)絡依據(jù)設計發(fā)揮功能的能量需求教學大綱掌握：漢密爾頓路徑問題了解：發(fā)現(xiàn)新藥，疾病治療，乙醇，高級醇，生物傳感系統(tǒng)，大腸桿菌香味劑合成基因線路與網(wǎng)絡的應用在醫(yī)藥工業(yè)領域中的應用在生物能源領域中的應用其他△在醫(yī)藥工業(yè)領域中的應用（1）發(fā)現(xiàn)新藥（2）疾病治療（1）發(fā)現(xiàn)新藥青蒿素（artemisinin）以其高效、快速、低毒等特點，被世界衛(wèi)生組織認定為21世紀最有效的抗瘧疾藥。青蒿草青蒿素含量普遍低于1‰，導致植物提取青蒿素的成本很高，產(chǎn)量一直供不應求，費用居高不下。利用合成生物學方法分別將相關基因植入大腸桿菌和酵母中，利用微生物合成青蒿素的前體物質(zhì)amorphadiene和青蒿酸。大腸桿菌焦磷酸異戊酯二甲基丙烯焦磷酸酯法尼基焦磷酸酯為避免大腸桿菌內(nèi)源DXP途徑的干擾，引入ispC基因，其編碼產(chǎn)物可將大腸桿菌內(nèi)源的DXP途徑阻斷。酵母抗生素乙硫異煙胺（ETH）一類重要的抗結核藥物，常用于感染具有多種耐藥抗性結核分枝桿菌患者的治療，結核分支桿菌酶EthA

ETH操縱子OethR

阻遏蛋白EthR篩選能夠穿過細胞膜到達細胞內(nèi)的病原體，使EthR失活且對哺乳動物細胞沒有毒性的復合物。哺乳動物轉錄反激活子EthR與VP16融合成一個新的轉錄因子與操縱子OethR結合激活下游哺乳動物啟動子激活報告基因篩選EthR抑制劑小分子酯類2-丁酸苯乙酯：能激活結核分枝桿菌中EthA的表達，使病原體對抗生素ETH更加敏感。匹諾塞林匹諾塞林具有良好的生物活性，如神經(jīng)保護、抗菌、抗氧化等，其中神經(jīng)保護方面活性使其具有極高的成藥性，在2009年匹諾塞林被CFDA批準為I類注射新藥，主要適應癥為急性腦卒中?；瘜W合成：可以快速得到產(chǎn)物，但需要使用大量有毒化學試劑，反應條件較苛刻。植物提?。罕M管匹諾塞林在植物中廣泛分布，但含量低、植物組織中物質(zhì)成分復雜和分離純化困難等一系列問題大大限制植物提取方法的應用。生物合成：原料價廉、反應要求較低、能耗低和環(huán)境友好等特點，具有很好的發(fā)展前景。苯丙氨酸裂解酶酪氨酸裂解酶肉桂酸4-羥化酶香豆酸輔酶A連接酶查爾酮合酶匹諾塞林查爾酮柚皮素查爾酮查爾酮異構酶柚皮素S構型的匹諾塞林莽草酸途徑噬菌體（bacteriophage）感染某些特定細菌破壞或者削弱耐藥菌的耐藥機制，加強抗生素的抗菌療效。設計噬菌體作為輔助用抗生素、合成安全性疫苗、去除病原菌種群、發(fā)現(xiàn)小分子化學治療藥物、設計新的生物藥品、闡明疾病機制等。（2）疾病治療（Diseasetreatment）在生物能源(bioenergy)領域中的應用（1）乙醇（2）高級醇（1）乙醇（ethanol）通過定向敲除策略，去除大腸桿菌中與乙醇代謝無關的路徑由于乙醇的低能量密度和高吸濕性，使其并不能成為理想的燃料。與