干細胞的體外培養(yǎng)技術原理及基本過程職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)

職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫干細胞的體外培養(yǎng)——技術原理及基本過程職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫一、技術原理職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫（一）技術原理基本原則：促進ES增殖的同時，維持其未分化的二倍體狀態(tài)。有飼養(yǎng)層（feederlayer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細胞（MouseEmbryoFirbroblasts,MEF）制備飼養(yǎng)細胞單層，主要是利用其分泌的生長因子FGF和抑制干細胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細胞在體外克隆而不分化。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備條件培養(yǎng)基。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫二、基本過程職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫飼養(yǎng)層細胞制備或條件培養(yǎng)基制備胚胎的制備和培養(yǎng)胚胎干細胞的分離胚胎干細胞的培養(yǎng)胚胎干細胞的鑒定凍存與復蘇細胞克隆形態(tài)堿性磷酸酶檢測核型的鑒定分化能力的觀察嵌合能力的測定職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫1、飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）：取孕12.5-14.5d鼠胚胎軀干，以植塊培養(yǎng)法或分散細胞培養(yǎng)法制備，取第三代至第五代細胞作為飼養(yǎng)層細胞。STO細胞：按照一般已建細胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采用胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存，用時復蘇。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫MEF和STO的優(yōu)缺點：MEF分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制分化因子的能力比STO強，STO作飼養(yǎng)細胞時常需在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長期傳代，需經(jīng)常準備懷孕小鼠制備第三代至第五代細胞，STO則可長期傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性，不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因的胚胎干細胞篩選用。SNL細胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因的STO細胞，可分泌足夠的抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞篩選。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫胚胎干細胞培養(yǎng)過程中，死亡MEF或STO的染色體可能導致胚胎干細胞的突變及影響正常核型的保持。不易獲得純的胚胎干細胞作為生化和分子生物學方面的分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余的絲裂霉素C會影響胚胎干細胞的增殖。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫2、飼養(yǎng)單層制備MEF或STO連成一片，以含10μg/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3h（如細胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或γ射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液，PBS洗5次，γ射線處理者不用清洗。消化細胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過（0.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面，室溫2h以上）的培養(yǎng)瓶，種植細胞數(shù)：MEF7.5×104-105個/cm2，STO為5×104個/cm2。培養(yǎng)至細胞連成一片沒有間隙（中間可補加處理過的細胞），制備好的飼養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱，5天內(nèi)使用，使用前換成干細胞培養(yǎng)液。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫觀察：好的飼養(yǎng)單層，細胞連成一片，無間隙，死亡細胞和雜細胞極少。MEF和STO產(chǎn)生的抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中，一部分錨定在細胞外基質(zhì)上。無間隙的飼養(yǎng)單層保證了胚胎干細胞都能與飼養(yǎng)層細胞接觸而達到最佳效果。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫3、用于培養(yǎng)胚胎干細胞的條件培養(yǎng)基直接在胚胎干細胞培養(yǎng)液中加入重組的LIF，使終濃度為1000U/ml。Baffalo大鼠肝細胞株BRL條件培養(yǎng)基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細胞分化的因子DIF。收集培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細胞培養(yǎng)液，再添加8-10%胎牛血清。年齡2-3周大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干細胞分化因子。收集1-6代細胞培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6份+3份胚胎干細胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫4、胚胎干細胞的分離和培養(yǎng)（1）培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水，不能有細菌內(nèi)毒素污染，水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：有助于囊胚貼壁、內(nèi)細胞團增殖及胚胎干細胞集落形成。使用前還要添加β-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（0.15mmol/L）：保護細胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的巰基不被氧化，促進胚胎干細胞的貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫血清缺點：成分復雜，不利于整合到胚胎干細胞基因組中外源性基因功能的測定；可能含有一些未知的促進胚胎干細胞分化的因子；含有微量的血紅蛋白和內(nèi)毒素，干擾胚胎干細胞生長。無血清胚胎干細胞培養(yǎng)液無上述缺點，但細胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫（2）胚胎干細胞的分離小鼠：母小鼠超數(shù)排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細胞，獲得內(nèi)細胞團（innercellmass，ICM），并分散為3-4個細胞在一起的細胞團職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫（3）胚胎干細胞培養(yǎng)有飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)：將內(nèi)細胞團吸置處理過的飼養(yǎng)層上，一個內(nèi)細胞團放置一個孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時，消化30s后棄消化液，殘余消化液繼續(xù)作用，當飼養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙（或顯微鏡下細胞之間分開），終止消化，一般為2-3min加適量培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細胞懸液，接種新飼養(yǎng)層擴大培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)：明膠包被培養(yǎng)板，條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細胞：將已培養(yǎng)2-3d生長旺盛干細胞消化成單細胞懸液，添加新的培養(yǎng)液，按照1：3或1：6比例轉(zhuǎn)鐘。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫注意事項：最初分離的內(nèi)細胞團以3-4個細胞團為宜，但集落形成后，傳代過程中一定要消化成單細胞，否則胚胎干細胞會互相誘導，易于分化。培養(yǎng)條件要始終如一。為了增強胚胎干細胞粘附力，除明膠包被外，還可以用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進粘附。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫（4）培養(yǎng)結(jié)果hES細胞集落（×10）胚胎干細胞呈集落狀（島嶼狀）生長，邊緣整齊，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長，細胞之間界限不清。消化成單細胞后細胞小而圓，核大，胞漿小。職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫小鼠胚胎生殖細胞的相位襯度圖像職業(yè)教育醫(yī)學生物技術專業(yè)教學資源庫小鼠胚胎生殖細胞培養(yǎng)皿含有數(shù)百個小鼠胚胎生殖細胞群的培養(yǎng)皿。每一個紅色染色的斑點代表一個由數(shù)百或數(shù)千個干細胞組成