園藝植物遺傳育種 課件 第9、10章 現(xiàn)代生物技術(shù)育種；新品種的審定與推廣繁育

園藝植物遺傳育種第一章

緒論第二章經(jīng)典遺傳與細(xì)胞質(zhì)遺傳第三章數(shù)量遺傳第四章園藝植物種質(zhì)資源與引種馴化第五章選擇育種第六章有性雜交育種第七章雜種優(yōu)勢(shì)利用第八章誘變育種第九章現(xiàn)代生物技術(shù)育種第十章新品種的審定與推廣繁育實(shí)訓(xùn)1-15第九章現(xiàn)代生物技術(shù)育種9.1概述9.2分子育種的遺傳基礎(chǔ)

9.2.1兩種核酸及其結(jié)構(gòu)9.2.2遺傳信息的傳遞規(guī)律9.3基因工程與育種

9.3.1基因工程的原理與技術(shù)9.3.2基因工程在園藝植物育種中的應(yīng)用9.3.3轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性及其對(duì)策9.4細(xì)胞工程與育種

9.4.1胚胎培養(yǎng)技術(shù)9.4.2加倍單倍體技術(shù)9.4.3原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞融合（雜交）技術(shù)9.4.4體細(xì)胞突變體篩選技術(shù)9.4.5植物快繁技術(shù)9.5分子標(biāo)記輔助育種

9.5.1分子標(biāo)記及其種類

9.5.2分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用

練習(xí)與思考

本章小結(jié)知識(shí)目標(biāo)●了解分子育種的遺傳基礎(chǔ)●掌握細(xì)胞工程的技術(shù)方法●了解基因工程的原理與技術(shù)以及分子育種技術(shù)種類●理解基因工程和分子育種技術(shù)在育種實(shí)踐中的應(yīng)用能力目標(biāo)●能應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行育種實(shí)踐操作●能開展園藝植物轉(zhuǎn)基因操作●能正確進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)9.1概述生物技術(shù)（biotechnology），也稱生物工程（bioengineering），是指以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)所需的產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的一門新興、綜合性學(xué)科。該學(xué)科主要包括細(xì)胞工程（cellengineering）、基因工程（geneengineering）技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇育種（markerassistedselection,MAS）；內(nèi)容主要涉及組織和器官培養(yǎng)（tissueandorganculture）、體細(xì)胞突變體的篩選（mutantsomaticselection）、原生質(zhì)體培養(yǎng)（protoplastculture）與體細(xì)胞雜交（somatichybridization）、單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（haploidcellculture）、體細(xì)胞胚胎發(fā)生與生物反應(yīng)器（somaticembryogenesisandbioreactor）、基因分離和轉(zhuǎn)移（geneisolationandtransfer）以及分子標(biāo)記輔助選擇育種（markerassistedselection，MAS）等技術(shù)。

以分子育種為前沿標(biāo)志的生物技術(shù)育種在園藝植物育種領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，并逐漸成為改良園藝植物品種、創(chuàng)造和擴(kuò)繁新種質(zhì)的捷徑。一批高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、高效新品種脫穎而出。如黃瓜新品種‘北京206’生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，可持續(xù)結(jié)瓜，適于春、秋大棚及春、秋、冬溫室種植；蘋果新品種‘七月’適應(yīng)性廣，品質(zhì)優(yōu)良，綜合經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)于‘遼伏’、‘貝拉’等早熟蘋果品種。9.2分子育種的遺傳基礎(chǔ)自ＤＮＡ雙螺旋結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)以來，隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，人們直接深入到ＤＮＡ分子水平改造園藝植物或其他動(dòng)、植物，從而創(chuàng)造新的動(dòng)、植物品種。這種通過直接或間接運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段選育新品種的途徑，稱為分子育種。分子育種技術(shù)主要有以下３種：一是選擇優(yōu)良基因進(jìn)行ＤＮＡ標(biāo)記；二是用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)入優(yōu)良性狀的基因；三是通過計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)分子育種的最佳方法。我國的植物分子育種研究計(jì)劃在主要植物分子標(biāo)記育種技術(shù)體系建設(shè)上已取得重要進(jìn)展：科研人員精細(xì)定位、克隆了一批新基因，開發(fā)了一批功能標(biāo)記，奠定了開展分子標(biāo)記育種的技術(shù)基礎(chǔ)；獲得了調(diào)控植物重要性狀的遺傳網(wǎng)絡(luò)信息，初步構(gòu)建了主要作物分子設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)庫及分子模擬系統(tǒng)，并應(yīng)用于品種分子設(shè)計(jì)育種；已經(jīng)成功地創(chuàng)制出一批優(yōu)異育種新材料和應(yīng)用于生產(chǎn)的新種質(zhì)。分子遺傳學(xué)是分子育種的理論基礎(chǔ)，下述內(nèi)容主要介紹分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)。細(xì)胞核中的染色體是由核酸和蛋白質(zhì)組成的，核酸是核苷酸的多聚體，因而它的構(gòu)成單元是核苷酸。每個(gè)核苷酸包括３部分：五碳糖、磷酸和環(huán)狀的含氮堿基；堿基包括嘌呤和嘧啶。核酸有兩種：脫氧核糖核酸（ＤＮＡ）和核糖核酸（ＲＮＡ）。試驗(yàn)證明：大多數(shù)生物體都以ＤＮＡ為遺傳信息的原初載體；少數(shù)ＲＮＡ病毒以ＲＮＡ為遺傳信息的原初載體；而蛋白質(zhì)主要是生物體遺傳信息的體現(xiàn)者，與生物體遺傳信息所規(guī)定的功能息息相關(guān)。9.2.1兩種核酸及其結(jié)構(gòu)兩種核酸的主要區(qū)別如下：ＤＮＡ含有的糖是脫氧核糖，ＲＮＡ含有的糖是核糖；ＤＮＡ含有的堿基是腺嘌呤（Ａ）、胞嘧啶（Ｃ）、鳥嘌呤（Ｇ）、胸腺嘧啶（Ｔ），ＲＮＡ含有的堿基前３個(gè)與ＤＮＡ完全相同，只有最后１個(gè)胸腺嘧啶被尿嘧啶（Ｕ）所代替；ＤＮＡ通常是雙鏈脫氧核糖核酸，ＤＮＡ分子是脫氧核苷酸多聚體。

1953年，沃森和克里克根據(jù)Ｘ射線對(duì)ＤＮＡ的衍射研究結(jié)果以及查格夫（ChargaffE,1951）關(guān)于堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，闡明了ＤＮＡ分子的空間結(jié)構(gòu)。一個(gè)ＤＮＡ分子有兩條多核苷酸鏈，這兩條鏈的走向是相反的，一條是從５′到３′，另一條是從３′到５′，二者呈逆平行狀態(tài)形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。在雙螺旋內(nèi)側(cè)，腺嘌呤與胸腺嘧啶之間配對(duì)，形成兩個(gè)氫鍵（Ａ==Ｔ）；鳥嘌呤與胞嘧啶之間配對(duì)，形成３個(gè)氫鍵（Ｇ==Ｃ）。各對(duì)堿基之間的距離為0.34ｎｍ，每轉(zhuǎn)一圈長(zhǎng)為3.4ｎｍ，包含10個(gè)堿基對(duì)，螺旋直徑２ｎｍ（圖9.2.1）。盡管絕大多數(shù)ＲＮＡ都是單鏈的，但在ＲＮＡ分子內(nèi)某些片段也可通過腺嘌呤與尿嘧啶之間配對(duì)（Ａ==Ｕ），鳥嘌呤與胞嘧啶之間配對(duì)（Ｇ==Ｃ），形成“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)（圖9.2.2）。ＤＮＡ分子的物種特異性主要決定于ＤＮＡ分子中４種堿基的比例和排列順序。（１）不同生物的ＤＮＡ其堿基比例（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）是不同的，雖然各種真核生物ＤＮＡ的堿基都是Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ４種，但（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）比例卻不同：高等植物和動(dòng)物往往Ａ＋Ｔ較多，而且在平均堿基組成上相對(duì)一致，但在較低等的真核生物中，（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）比例的差異就比較大。（２）４種堿基在一條多核苷酸鏈上排列的形式是多種多樣的，組成ＤＮＡ的堿基盡管只有４種，但對(duì)任何一個(gè)ＤＮＡ堿基位點(diǎn)來說，均有４１＝４種排列方式，即Ａ—Ｔ、Ｔ—Ａ、Ｇ—Ｃ、Ｃ—Ｇ；對(duì)兩個(gè)堿基位點(diǎn)來說，就有４２＝１６種排列方式；由n個(gè)核苷酸連接的核苷酸鏈，就有４n

種排列，即可以構(gòu)成４n種不同性質(zhì)的基因，從而使生物性狀表現(xiàn)得千差萬別。中心法則（geneticcentraldogmaｇ）是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從ＲＮＡ傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程；也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過程。這是所有具細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。在某些病毒（如煙草花葉病毒等）中的RNA自我復(fù)制和在某些病毒（某些致癌病毒）中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過程是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。細(xì)胞的遺傳物質(zhì)都是DNA，只有一些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。這種以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒稱為反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus），在這種病毒的感染周期中，單鏈RNA分子在反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）的作用下，可以反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，然后再以單鏈DNA為模板生成雙鏈DNA。雙鏈DNA可以成為宿主細(xì)胞基因組的一部分，并同宿主細(xì)胞的基因組一起傳遞給子細(xì)胞。在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，RNA分子產(chǎn)生與其序列互補(bǔ)的DNA分子，這種DNA分子稱為互補(bǔ)DNA（complementaryDNA），簡(jiǎn)寫為ｃDNA，這個(gè)過程即為反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）。9.2.2遺傳信息的傳遞規(guī)律9.2.2.1中心法則及其發(fā)展朊粒是一種蛋白質(zhì)傳染顆粒（Proteinaceousinfectiousparticle），它最初被認(rèn)識(shí)到是羊瘙癢病的病原體。研究證明，朊粒不是病毒，而是不含核酸的蛋白質(zhì)顆粒。一個(gè)不含ＤＮＡ或ＲＮＡ的蛋白質(zhì)分子能在受感染的宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生與自身相同的分子，且實(shí)現(xiàn)相同的生物學(xué)功能，即引起相同的疾病，這意味著這種蛋白質(zhì)分子也是負(fù)載和傳遞遺傳信息的物質(zhì)。試驗(yàn)證明，朊粒不是傳遞遺傳信息的載體，也不能自我復(fù)制，而仍是由基因編碼產(chǎn)生的一種正常蛋白質(zhì)的異構(gòu)體。因此中心法則可用下圖(圖9.2.3）表示。ＤＮＡ的復(fù)制過程非常復(fù)雜。首先，在復(fù)制起點(diǎn)處ＤＮＡ解旋酶將雙鏈ＤＮＡ解旋，形成復(fù)制叉，ＤＮＡ復(fù)制過程中，隨著兩條子鏈的延長(zhǎng)，復(fù)制叉不斷前移。子鏈ＤＮＡ總是按５′向３′的方向進(jìn)行合成，親鏈中原５′向３′的鏈復(fù)制時(shí)是連續(xù)合成的；而原３′向５′的鏈按岡崎片段復(fù)制，再由ＤＮＡ連接酶將其連接成子鏈。復(fù)制后每一個(gè)新的雙鏈ＤＮＡ分子都是由一條親鏈和一條新合成的子鏈組成（半保留復(fù)制）。由于ＤＮＡ的半保留復(fù)制是嚴(yán)格地按照堿基配對(duì)原則進(jìn)行的，因此，新合成的子鏈ＤＮＡ忠實(shí)地保存了親鏈ＤＮＡ所攜帶的全部遺傳信息。通過這樣的復(fù)制，基因便能夠代代相傳，準(zhǔn)確地保留下去。9.2.2.2

DNA復(fù)制與修復(fù)ＤＮＡ復(fù)制時(shí)可能由ＤＮＡ聚合酶引發(fā)偶然錯(cuò)誤，或者由于環(huán)境因素（如輻射、致突變的化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)）致使ＤＮＡ產(chǎn)生序列上的錯(cuò)誤，此時(shí)生物體內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)就會(huì)對(duì)ＤＮＡ變異起保護(hù)修復(fù)作用。ＤＮＡ修復(fù)主要包括３個(gè)步驟：①ＤＮＡ修復(fù)核酸酶對(duì)ＤＮＡ鏈上不正常堿基的識(shí)別與切除；②ＤＮＡ聚合酶對(duì)已切除區(qū)域的重新合成；③ＤＮＡ連接酶對(duì)剩余切口的修補(bǔ)。但ＤＮＡ的損傷或突變也不可能全部被修復(fù)，否則就不存在變異，生物也就不可能進(jìn)化了。因此遺傳是相對(duì)的，變異是絕對(duì)的，這是生物進(jìn)化過程中的必然現(xiàn)象。ＤＮＡ結(jié)構(gòu)在一些特殊的條件下（如高溫及強(qiáng)堿），雙鏈ＤＮＡ分子的氫鍵斷裂，兩條鏈完全分離，形成單鏈ＤＮＡ分子，這種情況稱為ＤＮＡ變性（denaturation）。變性的ＤＮＡ分子經(jīng)處理又可重新形成正常的ＤＮＡ分子，這個(gè)過程稱為復(fù)性（renaturation）或退火（annealing）。降低溫度、ｐＨ及增加鹽濃度均可促進(jìn)ＤＮＡ分子的復(fù)性（退火）。當(dāng)復(fù)性的ＤＮＡ分子由兩條不同的單鏈形成時(shí)，這種復(fù)性稱為雜交（hybridization）。9.2.2.3

DNA變性、雜交遺傳的穩(wěn)定性對(duì)于維持生物的生存是很重要的，但生物體的生存必須適應(yīng)環(huán)境變化，因此生物體的ＤＮＡ就會(huì)發(fā)生一些變異來適應(yīng)新環(huán)境，這是生物進(jìn)化的原動(dòng)力。生物遺傳的變化來自ＤＮＡ的重新排列，即基因重組?；蛑亟M具有重要的生物學(xué)意義。正是由于ＤＮＡ的變異、基因重組產(chǎn)生新的生物性狀甚至形成新物種，從而使人為地改變生物的遺傳特性成為可能，以獲得符合人類要求的生物新特性和生物新個(gè)體，這就是基因工程。9.2.2.4

基因重組9.3基因工程與育種植物基因工程（plantgeneticengineering）是指按照人們的愿望進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，經(jīng)過體外ＤＮＡ重組和轉(zhuǎn)移等技術(shù)，有目的地改造植物種性，使現(xiàn)有物種在較短時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出新種質(zhì)的過程。它是近30年來隨著ＤＮＡ重組技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而興起的生物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因作物綜合其性狀表現(xiàn)為抗蟲、抗除草劑、抗逆境等，其品質(zhì)得到改良、生長(zhǎng)發(fā)育得到調(diào)控、產(chǎn)量潛力大幅度提高，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ＩＳＡＡＡ）公布的數(shù)據(jù)，批準(zhǔn)種植轉(zhuǎn)基因作物的國家從1996年（商業(yè)化的第１年）的６個(gè)增加到2003年的18個(gè)，2009年種植轉(zhuǎn)基因作物的國家達(dá)到25個(gè)，種植面積達(dá)1.34億公頃，比2008年增長(zhǎng)７％。基因工程的４要素包括外源ＤＮＡ、受體細(xì)胞、載體分子和工具酶，它們是基因工程研究的主要內(nèi)容。（１）外源ＤＮＡ從分子本質(zhì)上講，所有的基因都具有相同的化學(xué)本質(zhì)，因此無論是微生物、植物和動(dòng)物的ＤＮＡ都可以作為另一種生物的外源ＤＮＡ。目前，目的基因主要來源于真核生物染色體組。原核生物的染色體組也有幾百上千的基因，也是目的基因的來源。此外，一些核外遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒基因組、病毒基因組、線粒體基因組和葉綠體基因組等也有少量基因，可作為進(jìn)行與之相關(guān)研究時(shí)的目的基因。9.3.1基因工程的原理與技術(shù)9.3.1.1

基因工程的要素（２）受體細(xì)胞大腸桿菌、枯草桿菌、酵母等低等生物體以及各種植物、動(dòng)物細(xì)胞都可以作為基因工程的受體細(xì)胞。但是需要這些受體細(xì)胞具備在試驗(yàn)技術(shù)上能夠攝取外源ＤＮＡ，并使目的基因穩(wěn)定存在下去；在試驗(yàn)?zāi)康纳鲜蔷哂袘?yīng)用價(jià)值并具有高品質(zhì)性狀的細(xì)胞；同時(shí)一個(gè)良好的受體細(xì)胞還應(yīng)具有較高的安全性，能高效表達(dá)目的基因，便于篩選重組體等特點(diǎn)。（３）載體分子基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具稱為載體。載體主要有以下幾類：質(zhì)粒載體、病毒載體、酵母人工染色體（ＹＡＣ）載體。①限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈ＤＮＡ分子中的某種特定核酸序列，并由此切割ＤＮＡ雙鏈結(jié)構(gòu)的酶。如：EcoＲⅠ、BamＨⅠ、BglⅡ等都是基因工程常用的限制性核酸內(nèi)切酶。②ＤＮＡ聚合酶ＤＮＡ聚合酶的共同特點(diǎn)在于，它們都能夠以ＤＮＡ為模板，把脫氧核苷酸連續(xù)地加到雙鏈ＤＮＡ分子引物鏈的３′－ＯＨ末端，催化核苷酸的聚合作用。ＤＮＡ聚合酶Ⅰ、Ｋｌｅｎｏｗ聚合酶和耐熱的ＴａｑＤＮＡ聚合酶等都是常用的ＤＮＡ聚合酶。

③連接酶ＤＮＡ連接酶能夠催化在兩條ＤＮＡ單鏈之間形成磷酸二酯鍵。目前基因工程中常用的是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４連接酶。④反轉(zhuǎn)錄酶一種依賴于ＲＮＡ單鏈為模板，通過ＤＮＡ聚合作用形成的ＤＮＡ聚合酶類。基因工程的操作過程大體包括以下幾個(gè)主要步驟。（１）取得或制備目的基因獲得目的基因的途徑很多，如可以從植物基因組中利用限制性內(nèi)切酶直接分離出帶有目的基因的ＤＮＡ片段；可以利用PCR技術(shù)從復(fù)雜的基因組擴(kuò)增出基因；或者利用ＤＮＡ合成儀人工化學(xué)合成目的基因的ＤＮＡ片段，獲得ＤＮＡ片段完整的目的基因等。9.3.1.2

基因工程的操作步驟（２）構(gòu)建重組載體將要克隆的ＤＮＡ分子通過黏性末端連接、平整末端連接、同聚末端連接或人工分子連接等方法，與載體ＤＮＡ分子連接起來，形成重組ＤＮＡ分子。構(gòu)建重組ＤＮＡ?xí)r應(yīng)注意連接一個(gè)控制目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng)子、一個(gè)控制目的基因轉(zhuǎn)錄終止的終止子和一個(gè)編碼特殊性質(zhì)蛋白質(zhì)的選擇標(biāo)記基因。（３）基因擴(kuò)增將構(gòu)建好的含有外源基因的重組載體導(dǎo)入對(duì)應(yīng)細(xì)菌中，利用細(xì)菌擴(kuò)增重組ＤＮＡ，達(dá)到基因擴(kuò)增的目的。（４）重組ＤＮＡ分子導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的方法有化學(xué)刺激法、電擊法、基因槍法、花粉管導(dǎo)入法、根瘤農(nóng)桿菌Ｔｉ質(zhì)粒介導(dǎo)法（圖9.3.1）、Ｒｉ質(zhì)粒介導(dǎo)法及植物病毒載體介導(dǎo)法等。植物遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的是基因槍法、農(nóng)桿菌Ｔｉ質(zhì)粒法。通過上述方法，將重組ＤＮＡ分子成功導(dǎo)入受體細(xì)胞。目標(biāo)植物的細(xì)胞受體系統(tǒng)可以是植物組織、植物體細(xì)胞或原生質(zhì)體甚至是花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞等生殖細(xì)胞。（５）檢測(cè)和培養(yǎng)通過選擇標(biāo)記基因可以檢測(cè)經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植物組織，在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)這些細(xì)胞和組織，使之形成大量的轉(zhuǎn)基因小苗。轉(zhuǎn)基因小苗還需要進(jìn)行檢測(cè)，目前對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定有ＤＮＡ的Southern雜交（檢測(cè)外源基因是否整合到植物染色體上）、Northern雜交（檢測(cè)外源基因是否在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)）以及Western雜交（檢測(cè)外源基因是否在翻譯水平上表達(dá)）或酶活性分析等方法，可根據(jù)目的和條件選用合適的方法。最好還要開展轉(zhuǎn)基因當(dāng)代和后續(xù)世代的田間目標(biāo)性狀的測(cè)定。檢測(cè)過程中均需設(shè)立對(duì)照。（６）轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模種植從轉(zhuǎn)基因植物中選出目的基因表達(dá)量高、綜合性狀優(yōu)良的品種進(jìn)行大規(guī)模種植。9.3.2基因工程在園藝植物育種中的應(yīng)用從1983年首例轉(zhuǎn)基因植質(zhì)改良、生物反應(yīng)器等方面。迄今國內(nèi)、外批準(zhǔn)商業(yè)化應(yīng)用的各類轉(zhuǎn)基因植物已近90種，僅美國和加拿大就超過50種。全球種植的大豆、玉米、棉花和卡諾拉油菜中有１/５以上是轉(zhuǎn)基因作物?；蚬こ淘趫@藝植物育種上的應(yīng)用目前主要有以下幾個(gè)方面。9.3.2.1創(chuàng)造園藝植物新種質(zhì)通過基因工程可創(chuàng)造常規(guī)育種手段難以獲得的園藝植物新種質(zhì)。例如，通過揭示控制花瓣色彩的各種色素的生化合成過程，分離出與花色素合成有關(guān)的一些關(guān)鍵基因，并將其轉(zhuǎn)入觀賞園藝植物中，從而為創(chuàng)造園藝植物新種質(zhì)開辟了道路。湖北大學(xué)生命科學(xué)院研制出一種熒光促進(jìn)劑，通過科學(xué)“誘導(dǎo)”，激發(fā)植物體內(nèi)潛在發(fā)光物質(zhì)發(fā)出熒光。無論是名貴的蘭花，還是普通的月季或菊花，在花朵含苞待放時(shí)，只需將這種特制的熒光促進(jìn)劑噴灑在花瓣上１次，這種花卉整個(gè)花期內(nèi)都會(huì)在黑暗中發(fā)出熒光。另外，科學(xué)家對(duì)花瓣條紋、彩斑等方面的研究也取得很大進(jìn)展。日本三得利（Ｓｕｎｔｏｒｙ）公司于２００４年６月３０日公布了世界首株成功開發(fā)的藍(lán)色玫瑰花的消息，該株玫瑰花的花瓣中所含的色素為藍(lán)色，純度接近１００％。9.3.2.2改良品質(zhì)一般糧食種子的儲(chǔ)存蛋白質(zhì)中幾種必需氨基酸的含量較低，直接影響到人類主食的營養(yǎng)價(jià)值。例如，禾谷類蛋白質(zhì)的賴氨酸含量低，豆類植物的甲硫氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含量低，將富含賴氨酸和甲硫氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因植入玉米中，可顯著提高其營養(yǎng)價(jià)值。目前已經(jīng)推出‘ＧｏｌｄｅｎｒｉｃｅⅡ’，該品種是將水仙花中的兩個(gè)基因和細(xì)菌中的一個(gè)基因一起導(dǎo)入水稻基因組，使水稻中的鐵元素、鋅元素和維生素Ａ的含量提高，有效防止貧血和維生素Ａ缺乏癥。康乃馨花期較短，為了延長(zhǎng)花期，澳大利亞的生物技術(shù)專家在康乃馨植株中引入一種基因，使花期延長(zhǎng)１倍，提高了觀賞性。9.3.2.3提高抗病蟲能力用基因工程技術(shù)提高植物抗病蟲能力是十分有效的。荷蘭一家植物生物技術(shù)公司應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出一種抗真菌草莓新品種，減少了草莓病害，并延長(zhǎng)了草莓保鮮期，經(jīng)濟(jì)效益明顯增加。蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）基因表達(dá)產(chǎn)物為毒性蛋白質(zhì)，對(duì)鱗翅目和鞘翅目的昆蟲（如小菜蛾）有很強(qiáng)的殺傷作用，但對(duì)脊椎動(dòng)物無毒，該基因被轉(zhuǎn)入棉花、楊樹、油菜等植物中，使植物的抗蟲能力極大提高。雪花蓮凝集素（galanthus

nivalisagglutining，GNA）是目前與害蟲治理有關(guān)且研究得比較多的一種單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素，GNA對(duì)同翅目的蚜蟲、葉蟬和稻飛虱表現(xiàn)出一定的毒殺作用，對(duì)咀嚼式口器的害蟲表現(xiàn)出中等毒殺作用，但對(duì)哺乳動(dòng)物基本無毒。近年來，人們采用基因工程的方法，將GNA基因?qū)胨?、煙草、小麥、玉米、萵苣、棉花、番茄、甘蔗、大白菜、油菜、新疆甜瓜等糧食或經(jīng)濟(jì)作物中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)同翅目的蚜蟲表現(xiàn)出較好的防治效果。9.3.2.4改善抗逆性植物對(duì)外部環(huán)境的適應(yīng)能力可通過基因工程技術(shù)大幅度提高。將熱激蛋白質(zhì)基因經(jīng)過一定改造后導(dǎo)入植物，可大幅度提高其抗熱性，拓展種植范圍。常用耐受脅迫相關(guān)的基因有編碼甘露醇的mtID

基因和編碼山梨醇的gutD

基因；真核生物的海藻糖合成酶基因Tps１和Tps２；催化谷氨酸合成脯氨酸的P5CS基因；合成甘氨酸甜菜堿的膽堿脫氫酶（ＣＤＨ）和膽堿氧化酶（ｃｏｄＡ）的基因等。這些基因的產(chǎn)物都能提高植物細(xì)胞的滲透壓，提高植物抗寒、抗凍、耐旱、耐鹽的能力。據(jù)報(bào)道，哈爾濱師范大學(xué)將深海魚美洲擬鰈的抗凍基因通過柱頭導(dǎo)入番茄，獲得可耐受-５～-４℃低溫的轉(zhuǎn)基因番茄。9.3.2.5提高光合作用和固氮效率通過提高二氧化碳固定反應(yīng)中的二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）的活性，降低其加氧酶活性，可顯著提高光合生產(chǎn)率。Rubisco是由葉綠體基因編碼的８?jìng)€(gè)大亞基（ｒｂｃＬ）和由核基因編碼的８?jìng)€(gè)小亞基（ｒｂｃＳ）組成的，將不同植物的Rubisco導(dǎo)入植物細(xì)胞形成雜合亞基酶分子或誘導(dǎo)點(diǎn)突變，修飾酶活性可達(dá)到提高光合效率的目的。把生物固氮的基因工程運(yùn)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，目標(biāo)主要有兩個(gè)：一是把非豆科作物，尤其是禾谷類作物轉(zhuǎn)變成固氮作物；二是提高現(xiàn)有固氮作物的固氮能力。1982年，Dwjong等率先把根瘤菌共生質(zhì)粒（攜有共生基因）的轉(zhuǎn)移應(yīng)用到育種中去，他們將豌豆根瘤菌128Ｃ53中的共生質(zhì)粒ｐＩＪ1008導(dǎo)入豌豆根瘤菌300菌株中，經(jīng)盆栽結(jié)瘤試驗(yàn)證明可使后者接種植株的固氮量增加３０％、干重增加１５％。此后，在大豆、菜豆、紫云英等植物中都進(jìn)行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)接受了外源共生基因的根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力及固氮酶活性的確有明顯變化，有的提高，有的降低。因此，闡明外源共生基因的作用機(jī)制以及尋找合適的外源共生基因的供體和受體是很有必要的。9.3.2.6創(chuàng)建雄性不育材料

1992年，Ｗo(hù)rral等用編碼β－１，３－萄聚糖水解酶基因轉(zhuǎn)化煙草、矮牽牛獲得雄性不育植株。1993年，LeemansＪ將核糖核酸酶基因嵌合到油菜染色體中，使其只在花藥的氈絨層中專性表達(dá)引起油菜雄性不育。目前，已發(fā)現(xiàn)許多可導(dǎo)致植物雄性不育的基因，正在進(jìn)行開發(fā)利用。9.3.2.7延遲成熟與保鮮果實(shí)細(xì)胞壁降解與果膠酶（多聚半乳糖醛酸酶ＰＧ和果膠甲酯酶ＰＥ）活性有關(guān)，通過ＰＧ和ＰＥ的克隆和反義遺傳轉(zhuǎn)化所獲得的番茄轉(zhuǎn)基因植株，其果實(shí)中ＰＧ和ＰＥ的活性受到顯著抑制，從而延遲果實(shí)的成熟。美國Ｃａｌｇｅｎｅ公司將ＰＧ反義基因?qū)敕眩嘤赊D(zhuǎn)基因新品種‘Ｆｌａｖｓａｖｒ’于1994年被批準(zhǔn)上市。1996年，葉志彪等通過用反義基因抑制ＡＣＣ合成酶的表達(dá)活性，抑制乙烯的合成，從而育成耐貯藏的轉(zhuǎn)基因番茄。9.3.2.8選育抗除草劑品種

1987年，科學(xué)家成功地從矮牽牛中克隆出在芳香族氨基酸生物合成中起關(guān)鍵作用的ＥＰＳＰ合成酶的基因，轉(zhuǎn)入油菜后，其葉綠體中ＥＰＳＰ合成酶的活性大大提高，對(duì)ＥＰＳＰ合成酶起抑制作用的高效廣譜滅生性除草劑草甘膦產(chǎn)生有效抗性。通過把降解除草劑的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)胨拗髦参?，從而保證宿主植物免受其害的方法已引起重視，并在煙草、番茄、馬鈴薯、油菜、大豆、楊樹中獲得轉(zhuǎn)基因抗磷酸麥黃酮類除草劑的品種等。美國一家生物技術(shù)公司推出了轉(zhuǎn)基因的匍匐翦股穎對(duì)草甘膦具有抗藥性，種植者可以完全放心地將草甘膦噴灑在抗性翦股穎草坪上，在殺死雜草的同時(shí)，不用擔(dān)心翦股穎會(huì)受到傷害。轉(zhuǎn)基因作物耐農(nóng)達(dá)ＲＲＲ除草劑甜菜在美國和加拿大已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。9.3.2.9植物生物反應(yīng)器

利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)的研究逐漸受到各國的重視，研究探索的熱點(diǎn)之一是利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所的科研人員將乙型肝炎病毒表面抗原基因?qū)腭R鈴薯和番茄，通過飼喂小鼠試驗(yàn)檢測(cè)到較高的保護(hù)性抗體，濃度足以對(duì)人類產(chǎn)生保護(hù)作用。該所還進(jìn)行了利用植物葉綠體作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)的探索，目前已將丙肝病毒（ＨＣＶ）抗原基因?qū)胍略迦~綠體。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗可以大大降低疫苗的生產(chǎn)成本，在發(fā)展中國家更有良好的發(fā)展前景。隨著我國1986年11月啟動(dòng)實(shí)施了“高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃”（863計(jì)劃），轉(zhuǎn)基因的研究步伐加快。21世紀(jì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)于我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和食物安全將發(fā)揮重要的作用。從目前情況看，抗蟲、抗除草劑基因工程產(chǎn)品開發(fā)較快，抗病基因工程的研究開發(fā)需要進(jìn)一步深入，抗逆、改良品質(zhì)、生長(zhǎng)發(fā)育等基因工程還有待基礎(chǔ)研究及取得新的突破。9.3.3轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性及其對(duì)策轉(zhuǎn)基因作物在進(jìn)行商品化生產(chǎn)之前，必須進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)價(jià)，必須完成各種安全評(píng)價(jià)程序和試驗(yàn)環(huán)節(jié)。研發(fā)單位在申請(qǐng)安全性評(píng)價(jià)時(shí)提交該轉(zhuǎn)基因作物詳盡的分子生物學(xué)資料，并通過國家指定的具有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行食品安全性評(píng)價(jià)；同時(shí)還要通過中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)等一系列田間試驗(yàn)，獲得生態(tài)環(huán)境安全性的資料，全過程一般需要６～８年。全部項(xiàng)目通過安全委員會(huì)綜合評(píng)價(jià)以后須經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，確保轉(zhuǎn)基因作物的食品和生態(tài)環(huán)境安全。9.3.3.1轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性環(huán)境安全性評(píng)價(jià)要回答的核心問題是轉(zhuǎn)基因植物釋放到田間去是否會(huì)將基因轉(zhuǎn)移到野生植物中，或是否會(huì)破壞自然生態(tài)環(huán)境，打破原有生物種群的動(dòng)態(tài)平衡。國內(nèi)、外專家對(duì)于轉(zhuǎn)基因給土壤生物和生物多樣性帶來的影響研究不多，但該問題也備受關(guān)注。Ｓａｘｅｎａ等發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲蛋白質(zhì)可以通過根部滲出物進(jìn)入土壤中，并且在適宜的土壤中持久的保持殺蟲活性?？傊D(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模種植，會(huì)對(duì)生物群落造成或多或少或直接或間接的影響。轉(zhuǎn)基因的逃逸是指導(dǎo)入植物的目的基因向野生的近緣種等非目標(biāo)生物流動(dòng)。如果抗除草劑植物的花粉將基因轉(zhuǎn)移到雜草中，將產(chǎn)生具有抗除草劑特點(diǎn)的“超級(jí)雜草”；外源基因隨花粉、風(fēng)、雨、鳥、昆蟲、細(xì)菌擴(kuò)散到整個(gè)生物鏈體系中，則可能對(duì)非靶生物造成基因污染而無法清理，只能永遠(yuǎn)繁殖下去；轉(zhuǎn)基因植物在生存競(jìng)爭(zhēng)上具有優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性降低。因此，我們必須嚴(yán)格控制被轉(zhuǎn)基因，以防其逃逸到自然環(huán)境中去。如使用安全載體和受體，造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離等。這樣，轉(zhuǎn)基因生物在進(jìn)入自然環(huán)境中以后就不可能自行繁殖，因此也就不可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成長(zhǎng)期的影響?？共《巨D(zhuǎn)基因植物的風(fēng)險(xiǎn)主要是病毒的重組和異源包殼問題。對(duì)于導(dǎo)入植物體的病毒外殼蛋白質(zhì)對(duì)人和其他生物本身是無害的，但是一旦它包裝了其他的病毒核酸，則可能產(chǎn)生病毒重組的潛在危險(xiǎn)。目前，已采取了一些措施防止重組病毒的產(chǎn)生，如限制導(dǎo)入基因的長(zhǎng)度、禁止使用產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)的基因等。9.3.3.2轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性食品安全性也是轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要方面。經(jīng)合組織于１９９３年提出食品安全性評(píng)價(jià)的實(shí)質(zhì)等同性原則。即如果轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實(shí)質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的；如轉(zhuǎn)病毒外殼蛋白質(zhì)基因的抗病毒植物及其產(chǎn)品與田間感染病毒的植物生產(chǎn)的產(chǎn)品都帶有外殼蛋白質(zhì)，這類產(chǎn)品應(yīng)該認(rèn)為是安全的；若轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品不存在實(shí)質(zhì)等同性，則應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的安全性評(píng)價(jià)。在進(jìn)行實(shí)質(zhì)等同性評(píng)價(jià)時(shí)，一般需要考慮以下兩個(gè)方面的問題。（１）有毒物質(zhì)必須確保轉(zhuǎn)入外源基因或基因產(chǎn)物對(duì)人畜無毒。如轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因玉米除含有Bt殺蟲蛋白質(zhì)外，與傳統(tǒng)玉米在營養(yǎng)物質(zhì)含量等方面具有實(shí)質(zhì)等同性。要評(píng)價(jià)它作為飼料或食品的安全性，則應(yīng)集中研究Bt蛋白質(zhì)對(duì)人畜的安全性。目前，已有大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明Bt蛋白質(zhì)只對(duì)少數(shù)目標(biāo)昆蟲有毒，對(duì)人畜絕對(duì)安全。（２）過敏源在自然條件下存在許多過敏源。在基因工程中如果將控制過敏源形成的基因轉(zhuǎn)入新的植物中，則會(huì)對(duì)過敏人群造成不利的影響。所以，轉(zhuǎn)入過敏源基因的植物不能批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)。如美國有人將巴西堅(jiān)果中的２Ｓ清蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆，雖然使大豆的含硫氨基酸增加，但也未獲批準(zhǔn)進(jìn)入商品化生產(chǎn)。另外還要考慮營養(yǎng)物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量等。9.3.3.3轉(zhuǎn)基因植物生物安全性問題的對(duì)策對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問題，應(yīng)排除狹隘的商業(yè)利害和信仰偏見的干擾，在目前科技水平還難以精確預(yù)測(cè)全部后果的情況下，采取避害趨利的必要措施?，F(xiàn)將有關(guān)方面已經(jīng)提出的策略、措施介紹如下：（１）深化和完善轉(zhuǎn)基因技術(shù)為了避免轉(zhuǎn)基因帶來的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)不斷完善轉(zhuǎn)基因過程中的相關(guān)技術(shù)。如采取轉(zhuǎn)入雙價(jià)基因的方法，即同時(shí)轉(zhuǎn)入目的基因和雄性不育基因，來阻斷轉(zhuǎn)基因植物花粉傳播可能帶來的外源基因擴(kuò)散問題；為了防止轉(zhuǎn)基因過程中采用標(biāo)記基因造成的生物安全問題，開展有關(guān)無標(biāo)記遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)和研究等。（２）加強(qiáng)對(duì)遺傳工程生物體及其產(chǎn)品的安全性和其他可能產(chǎn)生的危害進(jìn)行研究研究和開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品過程中，必須加強(qiáng)其安全性防范的長(zhǎng)期跟蹤研究。（３）建立完善的檢測(cè)體系和質(zhì)量審批制度為確保轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)出口的安全，必須建立一整套完善的、既符合國際標(biāo)準(zhǔn)又與我國國情相適應(yīng)的檢測(cè)體系，構(gòu)建嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)審批制度。審批機(jī)構(gòu)應(yīng)獨(dú)立于研發(fā)機(jī)構(gòu)之外，也不應(yīng)受到太多的行政干預(yù)。（４）不斷完善相關(guān)法規(guī)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性法規(guī)的建立和執(zhí)行應(yīng)該以嚴(yán)格的檢測(cè)手段為基準(zhǔn)，同時(shí)應(yīng)培養(yǎng)一批既懂生物技術(shù)知識(shí)、又能駕馭法律的專門人才。（５）加強(qiáng)宏觀調(diào)控有關(guān)決策層應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和市場(chǎng)化速度進(jìn)行有序調(diào)控。任何轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的防范措施都必須建立在對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行適當(dāng)調(diào)控的前提下，否則在商業(yè)利益的驅(qū)使下只能是防不勝防。（６）加強(qiáng)對(duì)公眾的宣傳和教育，為公眾提供良好的咨詢服務(wù)通過多渠道、多層次的科普宣傳教育，培養(yǎng)公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其安全性問題的客觀公正意識(shí)，從而培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品具有一定了解、認(rèn)識(shí)和判斷能力的消費(fèi)者群體。這對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品能否獲得市場(chǎng)的有力支撐是至關(guān)重要的。同時(shí)，應(yīng)該設(shè)立足夠數(shù)量的具有高度權(quán)威性的相關(guān)咨詢機(jī)構(gòu)，從而為那些因缺乏專業(yè)知識(shí)而難以對(duì)某些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品作出選擇的消費(fèi)者提供有效的指導(dǎo)性幫助。（７）規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場(chǎng)必須培育健康、規(guī)范的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場(chǎng)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性決定其在市場(chǎng)中的發(fā)展?jié)摿?。因此，有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量及其安全性的廣告宣傳應(yīng)該具有科學(xué)性和真實(shí)性。一旦消費(fèi)者因廣告宣傳而受誤導(dǎo)或因假冒產(chǎn)品而被欺騙，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品就會(huì)因消費(fèi)者的望而生畏從而失去市場(chǎng)。9.4細(xì)胞工程與育種植物細(xì)胞工程是以植物細(xì)胞全能性為理論基礎(chǔ)，以植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)為技術(shù)支持，在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平對(duì)植物進(jìn)行遺傳操作，實(shí)現(xiàn)植物改良和利用或獲得植物來源的生物產(chǎn)品的生物技術(shù)。植物細(xì)胞工程主要包括植物組織培養(yǎng)技術(shù)、胚胎培養(yǎng)技術(shù)、體細(xì)胞突變體篩選技術(shù)、原生質(zhì)體培養(yǎng)與細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）技術(shù)、加倍單倍體技術(shù)等。近年來，這些技術(shù)及其與常規(guī)育種技術(shù)的有效集成在快速繁育、種質(zhì)保存、品種選育和遺傳改良等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，顯示出巨大的潛力。9.4.1胚胎培養(yǎng)技術(shù)植物胚胎培養(yǎng)是胚、胚珠、子房和胚乳的離體培養(yǎng)技術(shù)，其應(yīng)用領(lǐng)域包括胚胎的發(fā)育機(jī)制、克服雜交不親和性、胚拯救、克服珠心胚的干擾、打破種子休眠、獲得體細(xì)胞胚和人工種子、建立植物高效再生體系等，并在農(nóng)作物、園藝作物、林木和藥用植物上廣泛應(yīng)用。9.4.1.1胚培養(yǎng)胚胎發(fā)生過程是從合子進(jìn)行第１次分裂開始，由未分化到分化直到分生組織形成、幼胚建立的連續(xù)漸進(jìn)變化的過程。不同發(fā)育階段的胚培養(yǎng)要求不同的培養(yǎng)條件，溫度和光照等環(huán)境條件也會(huì)影響到成敗。在子葉期之前的幼胚培養(yǎng)成功率與胚的大小有密切關(guān)系，多數(shù)研究表明，胚齡大小與成功率呈正相關(guān)，小于0.5ｍｍ的幼胚很難進(jìn)行培養(yǎng)。在未成熟胚胎的培養(yǎng)中，常見有３種明顯不同的生長(zhǎng)方式：第１種是繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長(zhǎng)”；第２種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗，而不繼續(xù)進(jìn)行胚性生長(zhǎng)，通常稱為“早熟萌發(fā)”；第３種是在許多情況下先形成愈傷組織，并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基，這種胚性愈傷組織是建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系或分離原生質(zhì)體的良好原始材料。9.4.1.2胚珠和子房培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)時(shí)，外植體的選取應(yīng)注意胚珠授粉的天數(shù)，對(duì)于球形胚或發(fā)育程度更高的胚珠，通過培養(yǎng)較易得到成熟種子。Maheshwari等將授粉６天后的罌粟離體胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了有生活力的種子。培養(yǎng)基的滲透壓會(huì)影響離體胚珠的發(fā)育，這對(duì)于較細(xì)嫩的胚珠更需強(qiáng)調(diào)之。如矮牽牛授粉后５天的球形期胚珠，在含４％～１０％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的蔗糖培養(yǎng)基中較合適；而對(duì)于合子胚期的胚珠，最適的蔗糖濃度為６％（體積分?jǐn)?shù)）；若在受精后進(jìn)行培養(yǎng)，其蔗糖最適濃度為８％（體積分?jǐn)?shù)）。此外，胎座對(duì)于胚珠培養(yǎng)也十分重要。

1942年，RueＬ首次開展了被子植物子房的培養(yǎng)；1951年，Nitsch成功培養(yǎng)了黃瓜、草莓、番茄、煙草和菜豆等的離體胚，從而奠定了子房培養(yǎng)技術(shù)。維生素和植物激素對(duì)于子房培養(yǎng)有顯著作用。Maheshwari等以授粉１天的屈曲花子房為外植體，在含無機(jī)鹽和蔗糖的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)胚比自然形成的?。欢谂囵B(yǎng)基中添加維生素Ｂ后，則獲得正常大小的果實(shí)；若再在培養(yǎng)基中添加ＩＡＡ，果實(shí)比自然形成的還大。天然植物提取物對(duì)于子房培養(yǎng)也有作用，如在蒔蘿和天仙子的合子期或雙細(xì)胞原胚期的子房培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中若添加椰子汁，其果實(shí)大小可超過天然果實(shí)。9.4.1.3胚乳培養(yǎng)在胚乳培養(yǎng)中，產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體的能力與胚乳發(fā)育的時(shí)期有密切的關(guān)系，一般而言，處于旺盛生長(zhǎng)期的胚乳最易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。但不同植物也有不同，蘋果、柚、黃瓜等未成熟胚乳培養(yǎng)比較適宜的時(shí)期是在授粉后７～１４天，超過一定時(shí)期則不能誘導(dǎo)愈傷組織；而巴豆、麻瘋樹、變?nèi)~木、荷葉芹等都需要在胚乳成熟期進(jìn)行培養(yǎng)，不僅誘導(dǎo)出愈傷組織，還有器官分化。胚乳培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基有White、ＭＳ和ＭＴ等，其中ＭＳ培養(yǎng)基用得最多。培養(yǎng)基中添加一定的天然提取物有利于獲得成功，如變?nèi)~木和葡萄的胚乳培養(yǎng)，若加一定量的椰子汁對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)是必需的。胚乳培養(yǎng)的主要目的是獲得具有利用價(jià)值的三倍體植株。1973年，印度的Srivastava首次從羅氏核實(shí)木的成熟胚乳成功培養(yǎng)出三倍體再生植株。目前，有40多種植物的胚乳培養(yǎng)達(dá)到了不同程度的細(xì)胞分化和器官分化，不少植物已得到再生植株。我國在馬鈴薯、小麥、水稻、蘋果、桃、獼猴桃等10多種植物上得到了胚乳再生植株。胚乳培養(yǎng)還可作為研究淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)合成和代謝的試驗(yàn)體系。通過胚乳培養(yǎng)產(chǎn)生的一些非整倍體，可以作為遺傳分析的材料。但相對(duì)于其他植物器官、組織和細(xì)胞的培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)相對(duì)較難，故應(yīng)用并不普遍。9.4.1.4離體授粉、受精植物離體受精可以通過離體柱頭授粉、離體子房授粉、離體胚珠授粉、離體精細(xì)胞和卵細(xì)胞融合等方法實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)可以克服植物雜交不親和的問題，同時(shí)也可以進(jìn)行胚胎、種子和果實(shí)發(fā)育機(jī)制等基礎(chǔ)研究。人工分離的精細(xì)胞和卵細(xì)胞融合后進(jìn)行合子胚培養(yǎng)，已在玉米等植物上獲得成功。植物離體受精技術(shù)是植物細(xì)胞工程中的重要試驗(yàn)技術(shù)，為研究植物胚胎發(fā)育機(jī)制提供了新的試驗(yàn)系統(tǒng)，為開發(fā)新的植物轉(zhuǎn)基因途徑提供了可能。9.4.2加倍單倍體技術(shù)加倍單倍體技術(shù)（doublehaploidtechnology）是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)單倍體植物材料（花藥、花粉、未受精的子房和胚珠）獲得單倍體植物，然后通過自然或人工加倍的方法獲得雙倍體植株的技術(shù)，其中以花藥和花粉培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛。9.4.2.1花藥培養(yǎng)在離體培養(yǎng)條件下，要使花藥中的花粉改變其正常發(fā)育方向而形成單倍體植株，需要各種因素來共同調(diào)節(jié)和控制。外因方面與培養(yǎng)基成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、糖濃度、培養(yǎng)溫度和光照有關(guān)；內(nèi)因主要決定于花藥中花粉發(fā)育的時(shí)期，最適宜的時(shí)期因植物種類和品種而不同，一般從單核早期到雙核期。此外，供體植株的生長(zhǎng)條件和植株年齡也會(huì)影響花藥的培養(yǎng)。在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的植株，常有倍性變異。形成非單倍體的原因有核融合、不正常的非單倍體花粉誘導(dǎo)生長(zhǎng)、花藥壁和花絲等參與愈傷組織的形成等。為此，可采取花粉培養(yǎng)方法或控制激素水平，抑制體細(xì)胞組織的發(fā)育而促進(jìn)小孢子的發(fā)育。9.4.2.2花粉（小孢子）培養(yǎng)花藥中的小孢子母細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成小孢子，小孢子核分裂形成生殖細(xì)胞和營養(yǎng)細(xì)胞后成為雄配子體，即成熟花粉。通常我們把小孢子和雄配子體統(tǒng)稱為花粉?；ǚ叟囵B(yǎng)實(shí)際上包括單核期花粉培養(yǎng)、雙核期花粉培養(yǎng)和成熟花粉培養(yǎng)３種。嚴(yán)格地講，小孢子只包括四分體解離后至第１次核有絲分裂時(shí)期的細(xì)胞，“小孢子培養(yǎng)”單指單核期花粉培養(yǎng)。但是，在培養(yǎng)工作中，由于花粉培養(yǎng)以小孢子培養(yǎng)為主，有時(shí)也將花粉培養(yǎng)與“小孢子培養(yǎng)”通用，將雙核期花粉培養(yǎng)甚至成熟花粉培養(yǎng)等統(tǒng)稱為“游離小孢子培養(yǎng)”?；ǚ叟囵B(yǎng)主要應(yīng)解決好花粉的分離及其培養(yǎng)兩個(gè)環(huán)節(jié)。分離花粉的方法有機(jī)械分離法和自然散落法兩種。常用的花粉培養(yǎng)方法主要有淺層液體培養(yǎng)法、看護(hù)培養(yǎng)法、平板培養(yǎng)法和微室懸滴培養(yǎng)法?；ǚ叟囵B(yǎng)與花藥培養(yǎng)的最大區(qū)別在于，它是將花粉從花藥中分離出來，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。因此花粉培養(yǎng)具有下列優(yōu)點(diǎn)：①可避免花藥培養(yǎng)過程中因存在有害物質(zhì)出現(xiàn)阻遏小孢子啟動(dòng)第１次分裂的問題，使小孢子胚胎及其再生植株的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于花藥培養(yǎng)；②無論是經(jīng)愈傷組織或胚狀體，最終獲得的小植株均為單倍體或雙單倍體，從遺傳學(xué)上而言均是純合植株；③小孢子培養(yǎng)可觀察由單細(xì)胞到雄核發(fā)育的全過程，誘變處理時(shí)，花粉能均勻地接觸化學(xué)和物理誘變劑，可揭示花粉吸收、轉(zhuǎn)化和誘變機(jī)制，因此它可作為遺傳與發(fā)育及誘變機(jī)制研究的理想材料。9.4.2.3離體雌核發(fā)育雌核發(fā)育（gynogenesis）是植物存在的自然現(xiàn)象，在離體條件下可以通過培養(yǎng)未受精的子房和胚珠產(chǎn)生單倍體植株，也可以在活體條件下通過授以不同種類的花粉或通過物理方法處理（如輻照處理）的花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育，目前已在小麥、水稻、玉米、甜菜、向日葵、馬鈴薯、西葫蘆、洋蔥、黃瓜、非洲菊、百合、小黑楊、三葉橡膠、煙草、矮牽牛等１０多種植物上獲得成功。影響雌配子體誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的影響因素有供體植物的基因型、供體植物的生長(zhǎng)環(huán)境、預(yù)處理、培養(yǎng)基等。離體條件下誘導(dǎo)孤雌生殖獲得加倍單倍體的技術(shù)發(fā)展時(shí)間不長(zhǎng)，現(xiàn)已開始應(yīng)用于作物的改良、構(gòu)建遺傳分析和轉(zhuǎn)基因的受體材料。9.4.3原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞融合（雜交）技術(shù)植物原生質(zhì)體是被去掉細(xì)胞壁的具有生活力的裸細(xì)胞。由于原生質(zhì)體比完整的細(xì)胞更容易攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器以及細(xì)菌和病毒等微生物，為研究高等植物遺傳轉(zhuǎn)化問題提供了較好的試驗(yàn)材料。同時(shí)，原生質(zhì)體在一定條件下可以誘導(dǎo)融合形成雜種細(xì)胞并分化形成植株，為育種開拓了一條新途徑，從而引起了人們的廣泛重視。原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的步驟如下。（１）原生質(zhì)體的分離要進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交，首先要獲得大量有活力的原生質(zhì)體。已經(jīng)從多種材料中成功地游離出原生質(zhì)體，如葉、花瓣、果肉、莖髓部、子葉、下胚軸、幼小的根、莖、葉、愈傷組織和懸浮細(xì)胞等，不同材料常具有某些不同特點(diǎn)，用得最普遍的是葉肉細(xì)胞、愈傷組織和懸浮細(xì)胞。通常高等植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，但也含有少量半纖維素、果膠質(zhì)和蛋白質(zhì)。不同植物細(xì)胞類型或不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期其細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)也不相同。要去掉細(xì)胞壁獲得有生活力的原生質(zhì)體通常用一步酶解法，即把一定量的用于酶解細(xì)胞壁的酶類（果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶和蝸牛酶等）組成混合酶溶液，材料放入其中處理即可分離得到原生質(zhì)體。研究表明，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和質(zhì)量受組織和細(xì)胞的生理狀態(tài)、酶的種類、溶液的組成成分以及滲透穩(wěn)定劑（Ｃａ２＋）的類型和濃度等的影響。在分離原生質(zhì)體的過程中常有很多殘余物，應(yīng)進(jìn)行純化，方法有離心沉淀法、飄浮法、滴洗法等。得到的原生質(zhì)體應(yīng)用形態(tài)、活性染色、熒光染料染色等方法測(cè)定活力。（２）原生質(zhì)體的培養(yǎng)培養(yǎng)原生質(zhì)體的基本營養(yǎng)同一般組培，但對(duì)某些組分，如鈣和碳源的水平要求更為嚴(yán)格。由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，在培養(yǎng)基中保持一定的滲透壓極為重要，故采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基是獲得培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)基有ＭＳ培養(yǎng)基、Ｂ５培養(yǎng)基等。多數(shù)植物的原生質(zhì)體適宜培養(yǎng)后１～３天再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)在原生質(zhì)體體積稍有增加、膨大，繼而由圓形變?yōu)槁褕A形，這是新壁形成的特征。在胞壁形成的同時(shí)，胞質(zhì)增加，液泡減少或消失，葉綠體或顆粒內(nèi)含物可分散在胞質(zhì)中也可圍繞在細(xì)胞核的周圍，并開始出現(xiàn)分裂，多數(shù)能進(jìn)行持續(xù)分裂。許多植物的分裂結(jié)果是形成愈傷組織，有的形成胚狀體然后長(zhǎng)成植株，有的先形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成胚狀體，經(jīng)進(jìn)一步的培養(yǎng)和處理可發(fā)育成為完整植株。（３）體細(xì)胞雜交以體細(xì)胞原生質(zhì)體為親本進(jìn)行融合的一種細(xì)胞工程技術(shù)，是建立在植物組織、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上。主要包括以下３個(gè)環(huán)節(jié)：①原生質(zhì)體融合主要有ＰＥＧ法、電融合法、高鈣高ｐＨ法、ＮａＮＯ３法等；②雜種細(xì)胞篩選目前主要采用突變細(xì)胞遺傳互補(bǔ)選擇法、營養(yǎng)互補(bǔ)選擇法和根據(jù)原生質(zhì)體特性差異的機(jī)械選擇法；③體細(xì)胞雜種植株鑒定主要方法有形態(tài)學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)（染色體）方法、同工酶法、分子標(biāo)記法、熒光原位雜交技術(shù)等。原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交是植物細(xì)胞工程的核心技術(shù)之一，為克服植物遠(yuǎn)緣雜交不親和性、創(chuàng)造新的種質(zhì)資源、實(shí)現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化和進(jìn)行細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)研究提供了重要的技術(shù)支撐。目前，獲得的原生質(zhì)體再生植株包括糧食作物、蔬菜、果樹、花卉、林木、藥用植物以及真菌和海藻等。利用體細(xì)胞融合技術(shù)可以克服有性雜交不親和性，創(chuàng)造新的物種或類型，實(shí)現(xiàn)植物種間、屬間，甚至科間的體細(xì)胞雜交，如番茄＋馬鈴薯、甘薯栽培種＋野生種、甘藍(lán)＋白菜、擬南芥＋甘藍(lán)型油菜、酸橙＋甜橙、紅橘＋枳殼的雜種培育等。利用細(xì)胞融合技術(shù)還獲得了一些特異的新種質(zhì)，如細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻、細(xì)胞質(zhì)雄性不育煙草等。盡管目前已在多種植物上建立了體細(xì)胞雜交和遺傳操作的技術(shù)程序，但還有相當(dāng)多的植物在原生質(zhì)體培養(yǎng)上存在技術(shù)困難，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)多學(xué)科的交叉研究以及技術(shù)集成和創(chuàng)新。9.4.4體細(xì)胞突變體篩選技術(shù)隨著國內(nèi)、外學(xué)者應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)篩選突變體取得一些成果，組織培養(yǎng)逐漸成為遺傳變異的一個(gè)重要來源。近年來，除了利用愈傷組織繼代過程中產(chǎn)生的自發(fā)突變以外，還采用射線、甲基磺酸乙酯等物理或化學(xué)因素誘發(fā)變異，并在細(xì)胞水平上進(jìn)行抗性突變體的篩選，可以大大減少植物改良所需投入的人力、物力。與常規(guī)育種方法相比，離體篩選具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可以獲得廣泛的變異類型，甚至產(chǎn)生自然界尚未發(fā)現(xiàn)的突變，為抗病選擇提供遺傳基礎(chǔ)；②可以在較小空間內(nèi)培養(yǎng)和處理大量細(xì)胞；③在細(xì)胞水平上直接誘發(fā)和篩選突變體，是高等植物抗性育種微生物化的一種嘗試，易于從單倍體細(xì)胞選出隱性突變，經(jīng)加倍成為二倍體或雙倍體，較快地得到純合穩(wěn)定的抗病材料；④在人工控制條件下體外定向選擇，易于進(jìn)行同位素示蹤、半微量分析等試驗(yàn)，不受地區(qū)和季節(jié)限制；⑤可以從細(xì)胞、組織及整株水平上進(jìn)行生化、遺傳和抗病機(jī)制的研究。（１）突變細(xì)胞的篩選方法常用的有直接選擇法和間接選擇法。直接選擇法是指新的突變表型在選擇條件下能優(yōu)先生長(zhǎng)，或預(yù)期在感觀上可測(cè)定其他可見的差異。直接選擇法分為正選擇和負(fù)選擇兩種類型。正選擇是用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基中正常型的細(xì)胞不能生長(zhǎng)，只有突變體才能生長(zhǎng)，借此可以分離出突變體細(xì)胞。如果加入培養(yǎng)基中的選擇劑的劑量較高，可以一次性地有效抑制或殺死所需突變體以外的其他細(xì)胞，使突變體保留下來，這種選擇方式稱為一步選擇系統(tǒng)。但若開始加入培養(yǎng)基的選擇劑劑量較低，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)只有少量的細(xì)胞生長(zhǎng)，９０％的細(xì)胞不能生長(zhǎng)，從中選擇生長(zhǎng)較好的細(xì)胞，然后依次增加選擇劑的濃度，進(jìn)行第２輪、第３輪的篩選，最后得到抗性的細(xì)胞，這種選擇方式稱為多步選擇系統(tǒng)。一步選擇系統(tǒng)得到的突變體較多是單基因突變。多步選擇系統(tǒng)的生化背景不詳，獲得的突變體可能是多基因變化的突變體，這種突變體較為有效。負(fù)選擇是用特定的培養(yǎng)基使突變體細(xì)胞處于不能生長(zhǎng)的狀態(tài)，而正常型的非突變細(xì)胞則可以生長(zhǎng)，然后用一種能使生長(zhǎng)中的細(xì)胞中毒死亡的汰選劑淘汰這些細(xì)胞，最后使未中毒的突變細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并分離出來。負(fù)選擇法常用于分離營養(yǎng)缺陷型突變細(xì)胞。間接選擇法是借助與突變表型有某種相關(guān)的特征作為間接選擇指標(biāo)的選擇方法。如在離體培養(yǎng)細(xì)胞中直接選擇抗旱性是困難的，可通過選擇抗羥脯氨酸類似物的突變體，從而間接篩選抗旱突變體。此外，突變體還可利用ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＲ、ＳＣＡＲ等分子標(biāo)記技術(shù)（詳見9.5節(jié)內(nèi)容）進(jìn)行選擇。（２）突變性狀的遺傳基礎(chǔ)及其穩(wěn)定性鑒定利用選擇培養(yǎng)基開展突變體選擇時(shí)，能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞并非均為突變細(xì)胞。一部分細(xì)胞有可能由于沒充分與選擇劑相接觸而殘留下來，還有可能經(jīng)過選擇后獲得的是非遺傳的變異細(xì)胞。鑒別經(jīng)選擇出來的細(xì)胞是否性狀穩(wěn)定時(shí)，常用的方法是讓細(xì)胞或組織在沒有選擇劑的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，如果仍能表現(xiàn)選擇出來的變異性狀，便可確認(rèn)為是突變細(xì)胞或組織。鑒別從變異細(xì)胞或組織再分化形成的植株是否為突變植株時(shí)，可用所形成的植株開花結(jié)實(shí)后的發(fā)芽種子或者用種子長(zhǎng)成的植株為材料，誘導(dǎo)其形成愈傷組織，再轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行檢驗(yàn)。如果所選擇的突變性狀是可以在植株個(gè)體水平表達(dá)的性狀時(shí)，如抗病性等，也可以用再生植株本身進(jìn)行鑒定。細(xì)胞突變的誘發(fā)以及細(xì)胞突變體的篩選標(biāo)志著誘變育種已向細(xì)胞水平進(jìn)展。目前，利用培養(yǎng)細(xì)胞與組織進(jìn)行離體篩選的研究主要集中在營養(yǎng)缺陷型、抗病、抗鹽、抗除草劑、抗溫度脅迫、抗水分脅迫等突變體的篩選方面。通過突變體的離體篩選已得到抗黑根病的甘藍(lán)、抗青枯病和萎蔫病的番茄、抗枯萎病的芹菜、抗根腐病的萵苣、抗萎蔫病的馬鈴薯、抗枯萎病的菜豆、耐鹽的楊樹、耐堿的毛白杜鵑、抗?jié)儾〉臍W洲落葉松等。但由于這一技術(shù)歷史較短，在應(yīng)用上受到組織培養(yǎng)技術(shù)、分離篩選突變體的方法和水平，以及變異表型能否穩(wěn)定等多方面的限制。只有在搞清細(xì)胞變異體表型發(fā)生變化的原因、性質(zhì)及其遺傳傳遞規(guī)律的基礎(chǔ)上，細(xì)胞突變體的篩選及其利用才能發(fā)揮更大的作用。9.4.5植物快繁技術(shù)植物快繁技術(shù)應(yīng)用于高附加值經(jīng)濟(jì)植物、珍稀瀕危植物、轉(zhuǎn)基因植物、育種原種以及植物脫毒苗的快繁，是植物細(xì)胞工程中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。利用超低溫保存種質(zhì)法結(jié)合快繁技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源的中長(zhǎng)期保存和利用；通過莖尖培養(yǎng)或利用組織培養(yǎng)技術(shù)并結(jié)合物理、化學(xué)方法獲得無毒苗，成為植物細(xì)胞工程技術(shù)的重要方面。我國開展植物快繁技術(shù)研究較早，于２０世紀(jì)７０年代中期開始規(guī)?；参锟旆泵摱镜难芯亢蛻?yīng)用，植物種類包括果樹、蔬菜、花卉、林木、藥用植物等，其中以脫毒馬鈴薯、蘭花、甘蔗、香蕉、葡萄、草莓、蘋果、柑橘、楊樹等規(guī)模較大。植物快繁生物反應(yīng)器的出現(xiàn)為植物快繁技術(shù)帶來根本性變革，成為快繁技術(shù)發(fā)展的新方向。植物快繁生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)規(guī)模大、便于自動(dòng)化控制、顯著降低玻璃化苗的比例、降低成本和污染以及節(jié)約人力資源等特點(diǎn)，目前已在木薯、馬鈴薯、咖啡、橡膠、菠蘿、甘蔗、香蕉、蘋果、梨等植物上獲得成功。利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)大量繁殖體和制作人工種子，可實(shí)現(xiàn)人工種子生產(chǎn)的規(guī)模化，為植物快繁、雜種優(yōu)勢(shì)利用和種業(yè)發(fā)展帶來革命性的變化。9.5分子標(biāo)記輔助育種生物技術(shù)的發(fā)展給植物遺傳育種研究提供了新的手段，分子標(biāo)記作為一種基本的遺傳分析手段，是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種新的較為理想的遺傳標(biāo)記（geneticmarker）。遺傳標(biāo)記是指可以穩(wěn)定遺傳的、易于識(shí)別的、特殊的遺傳多態(tài)性形式。9.5.1分子標(biāo)記及其種類自20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)是通過遺傳物質(zhì)ＤＮＡ序列的差異來進(jìn)行標(biāo)記，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①直接以ＤＮＡ的形式表現(xiàn)，在植物的各個(gè)組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境的影響，不存在表達(dá)與否的問題；②數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組；③多態(tài)性高，自然存在許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；④不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖遺傳現(xiàn)象；⑤許多分子標(biāo)記能夠鑒別純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息。由于分子標(biāo)記具有較大的優(yōu)越性，其應(yīng)用越來越廣泛。從發(fā)展進(jìn)程上可將其分成３個(gè)世代：第１代是以傳統(tǒng)的Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ＲＦＬＰ）；第２代是以ＰＣＲ為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)或微衛(wèi)星（ＳＳＲ）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ＡＦＬＰ）、特異序列擴(kuò)增區(qū)域（ＳＣＡＲ）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（ＣＡＰｓ，又稱ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）、序列標(biāo)簽位點(diǎn)（ＳＴＳ）等；第３代是以基因組序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如單核苷酸多態(tài)性（ＳＮＰ）、插入或刪除（insertdelete）、編碼簡(jiǎn)單序列（codingsimolesequencerepeat）及表達(dá)序列標(biāo)簽（ＥＳＴ）等。（１）ＲＦＬＰ標(biāo)記基本原理是由于酶識(shí)別序列內(nèi)的點(diǎn)突變或部分ＤＮＡ片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位點(diǎn)的缺失或獲得，導(dǎo)致限制性位點(diǎn)改變，再利用限制性內(nèi)切酶切割ＤＮＡ?xí)r，就產(chǎn)生了大量的多態(tài)性片段。該標(biāo)記具有共顯性特點(diǎn)，可以區(qū)別純合基因型與雜合基因型，能夠提供單個(gè)位點(diǎn)上較完整的資料。結(jié)果穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，特別適合于連鎖圖譜的建立。（２）ＲＡＰＤ標(biāo)記以一個(gè)隨機(jī)的寡核苷酸序列（通常為１０個(gè)堿基）為引物，通過ＰＣＲ對(duì)基因組ＤＮＡ進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，產(chǎn)生大小不同的ＤＮＡ片段，再經(jīng)凝膠電泳分開，進(jìn)行多態(tài)性觀察。與ＲＦＬＰ相比，ＲＡＰＤ方法簡(jiǎn)單、快速，靈敏度高，ＤＮＡ用量少，而且不需要用同位素標(biāo)記，安全性好。但是由于ＲＡＰＤ的重復(fù)性差，穩(wěn)定性不好，不能區(qū)分雜合基因型與純合基因型，所以限制了它的利用。（３）ＳＳＲ標(biāo)記基因組中存在的由２～５個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。這種序列廣泛分布于真核生物基因組，其重復(fù)次數(shù)的不同就產(chǎn)生了等位基因之間的多態(tài)性。由于ＳＳＲ兩端多為相對(duì)保守的單拷貝序列，通過設(shè)計(jì)引物便可以進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。（４）ＡＦＬＰ標(biāo)記通過對(duì)基因組ＤＮＡ酶切片段的選擇性擴(kuò)增來檢測(cè)ＤＮＡ酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。ＡＦＬＰ揭示的ＤＮＡ多態(tài)性是酶切位點(diǎn)及其后的選擇性堿基的變異，ＡＦＬＰ擴(kuò)增片段的譜帶數(shù)取決于采用的內(nèi)切酶和引物３′端選擇堿基的種類、數(shù)目及所研究的基因組的復(fù)雜性。由于ＡＦＬＰ是限制性酶切與ＰＣＲ結(jié)合的一種技術(shù)，因此具有ＲＦＬＰ技術(shù)的可靠性和ＰＣＲ技術(shù)的高效性，可以在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)大量限制性片段，一次可獲得５０～１００條譜帶的信息，可為不同來源以及不同復(fù)雜程度基因組的分析提供一個(gè)有力的工具。（５）ＳＴＳ標(biāo)記一種將ＲＦＬＰ標(biāo)記轉(zhuǎn)化為ＰＣＲ標(biāo)記的方法。它通過ＲＦＬＰ標(biāo)記或探針進(jìn)行ＤＮＡ序列分析，然后設(shè)計(jì)出長(zhǎng)度為20ｂｐ左右的引物，對(duì)基因組ＤＮＡ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增尋找多態(tài)性。它的擴(kuò)增產(chǎn)物是一段長(zhǎng)幾百堿基對(duì)的特異序列，此序列在基因組中往往只出現(xiàn)１次，因此能夠界定基因組的特異位點(diǎn)。ＳＴＳ標(biāo)記的信息量大、多態(tài)性好，是共顯性標(biāo)記，能夠鑒定不同的基因型。（６）ＳＣＡＲ標(biāo)記在ＲＡＰＤ技術(shù)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記。其方法是將目標(biāo)ＲＡＰＤ標(biāo)記克隆并進(jìn)行末端測(cè)序，根據(jù)原ＲＡＰＤ片段兩端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常為24ｂｐ），對(duì)基因組ＤＮＡ再進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增分析。ＳＣＡＲ標(biāo)記是共顯性遺傳，與ＲＡＰＤ標(biāo)記相比有更好的穩(wěn)定性、更高的可重復(fù)性。（７）ＣＡＰｓ標(biāo)記又稱為ＰＣＲ－ＲＦＬＰ。所用的ＰＣＲ引物是針對(duì)特定的位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。其基本步驟是先進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切，電泳分析多態(tài)性。與ＲＦＬＰ技術(shù)一樣，ＣＡＰｓ技術(shù)檢測(cè)的多態(tài)性是酶切片段大小的差異。（８）ＳＮＰ標(biāo)記用于測(cè)定同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化，是繼ＲＦＬＰ和ＳＳＲ之后一種新的分子標(biāo)記。它是對(duì)某特定區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，將其與相關(guān)基因組中對(duì)應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列比較，檢測(cè)出單個(gè)核苷酸的差異，這個(gè)有差異的ＤＮＡ區(qū)域被稱為ＳＮＰ標(biāo)記。ＳＮＰ標(biāo)記在大多數(shù)基因組中存在較高的頻率，數(shù)量豐富，可進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。（９）EST標(biāo)記長(zhǎng)度為150～500ｂｐ的基因表達(dá)序列片段。EST技術(shù)是將ｍRNA反轉(zhuǎn)錄成ｃDNA，并克隆到質(zhì)?；蚴删w載體構(gòu)建成ｃDNA文庫后，大規(guī)模隨機(jī)挑選ｃDNA克隆，對(duì)其５′或３′端進(jìn)行一步法測(cè)序，所獲序列與基因數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比較，從而獲得對(duì)生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、繁殖、衰老、死亡等一系列生理、生化過程認(rèn)知的技術(shù)。以EST為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記具有開發(fā)簡(jiǎn)便、信息量高和通用性好等特點(diǎn)。根據(jù)開發(fā)的方法不同，ＥＳＴ標(biāo)記可分為以下４類：①EST-SSR和EST

-PCR（微衛(wèi)星）標(biāo)記以ＰＣＲ技術(shù)為核心，操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，是目前研究和應(yīng)用最多的一類；②EST-SNP（單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記以特定EST區(qū)段內(nèi)單個(gè)核苷酸差異為基礎(chǔ)的標(biāo)記，可依托雜交、PCR等多種手段進(jìn)行檢測(cè)；③EST-ＡＦＬＰ標(biāo)記以限制性內(nèi)切酶技術(shù)和PCR相結(jié)合為基礎(chǔ)的標(biāo)記；④EST-ＲＦＬＰ標(biāo)記以限制性內(nèi)切酶和分子雜交為依托，以EST本身作為探針，與經(jīng)過不同限制性內(nèi)切酶消化后的基因組ＤＮＡ雜交而產(chǎn)生的。9.5.2分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用分子標(biāo)記可廣泛應(yīng)用于育種研究。下面就目前分子標(biāo)記在園藝植物育種中的主要應(yīng)用內(nèi)容介紹如下。9.5.2.1分析親緣關(guān)系和植物的起源演化問題分子標(biāo)記所檢測(cè)的是植物基因組ＤＮＡ水平的差異，具有穩(wěn)定客觀的特點(diǎn)，且引物多，借助分子遺傳圖譜對(duì)品種之間的比較可覆蓋整個(gè)基因組，從而可為物種、變種、品種和親緣類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供大量的ＤＮＡ分子水平的證據(jù)；為種質(zhì)資源的鑒定與保存、探究物種的起源與進(jìn)化、遠(yuǎn)緣雜交親本的選配、預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)等提供理論依據(jù)。自從1980年Bostein和White等首次提出用ＲＦＬＰ作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜以來，遺傳作圖得到飛速發(fā)展。目前，已構(gòu)建番茄、黃瓜、白菜、西瓜、胡蘿卜、蘋果、葡萄、櫻桃、楊樹、松樹、桉樹、云杉、紅豆杉、柳杉、花旗松等多種園藝植物的分子遺傳圖譜。分子遺傳圖譜構(gòu)建為園藝植物品種資源的研究、育種中親本材料的選擇和選配以及育種方案的制定提供了依據(jù)，也為物理圖譜的構(gòu)建、基因定位和克隆等奠定了基礎(chǔ)。9.5.2.2構(gòu)建遺傳圖譜園藝植物性狀可區(qū)分為質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀，因此在開展其基因定位過程中應(yīng)區(qū)別處理。目前，質(zhì)量基因的定位方法主要有兩種：①利用近等基因系或分離群體分組分析法（bulkedsegregateanalysis,BSA），BSA是將Ｆ2分離群體中研究的目標(biāo)性狀，根據(jù)其表型（如抗病和感病）分成兩組，將每組內(nèi)一定數(shù)量植株的DNA混合，形成按表型區(qū)分的DNA池，也稱近等基因池（isogenicDNApool），待用作模板進(jìn)行RAPD分析；②利用已有的連鎖圖進(jìn)行標(biāo)記，一旦發(fā)現(xiàn)某一目標(biāo)基因被定位在某一染色體上，就可以選擇分散在染色體不同位點(diǎn)的標(biāo)記逐漸逼近，找到該基因的分子標(biāo)記。這些與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，使進(jìn)一步克隆目標(biāo)基因、進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移成為可能。如萵苣抗霜霉病基因的定位就是通過BSA法實(shí)現(xiàn)的。對(duì)于尚無連鎖圖或連鎖飽和程度較低的植物，BSA法可為獲得與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記提供快速有效的途徑，可通過基于性狀表型的BSA法和基于標(biāo)記基因型的BSA法來實(shí)現(xiàn)。9.5.2.3基因定位而對(duì)于數(shù)量性狀的基因定位，可通過數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitloci,QTL）作圖來完成，其實(shí)質(zhì)就是通過確定數(shù)量性狀位點(diǎn)與分子標(biāo)記間的連鎖關(guān)系實(shí)現(xiàn)QTL作圖。用于QTL作圖的群體最好是永久性群體，如重組近交系和加倍單倍體群體。開始時(shí)，分離群體用單標(biāo)記分析方法進(jìn)行QTL的定位。例如，在一個(gè)Ｆ2群體中，給予任何一個(gè)特定的標(biāo)記Ｍ，若所有Ｍ１Ｍ１同質(zhì)個(gè)體的表型平均值高于Ｍ２Ｍ２同質(zhì)個(gè)體，那么就可以推薦存在一個(gè)QTL與這個(gè)標(biāo)記連鎖。如果顯著水平設(shè)置太低，這種方法的假陽性高。應(yīng)用分子標(biāo)記通過與目的基因相連鎖的標(biāo)記物（如ＤＮＡ片段）的間接選擇來選擇所期望的基因型。這種間接選擇具有許多優(yōu)點(diǎn)：①通過分子標(biāo)記可以進(jìn)行早期選擇，把不具備所期望性狀基因型的個(gè)體淘汰掉，這樣既可節(jié)省開支，又可加快育種進(jìn)度；②可區(qū)別較細(xì)微的差異，有些性狀，如多位點(diǎn)控制的數(shù)量性狀，個(gè)體間差異并不明顯，造成直接選擇的困難；

9.5.2.4分子標(biāo)記輔助選擇③不需要對(duì)育種材料進(jìn)行接種試驗(yàn)，可同時(shí)對(duì)幾個(gè)性狀進(jìn)行選擇，而用傳統(tǒng)的方法對(duì)幾個(gè)表現(xiàn)時(shí)期不同的性狀很難同時(shí)進(jìn)行直接選擇。例如在回交育種過程中，隨著有利基因的導(dǎo)入，與有利基因連鎖的不利基因（或染色體片段）也會(huì)隨之導(dǎo)入，成為連鎖累贅。利用與目的基因緊密連鎖的ＤＮＡ標(biāo)記，可以選擇在目的基因附近發(fā)生重組的個(gè)體，顯著減少連鎖累贅，提高選擇的效率。利用分子標(biāo)記輔助選擇，首先要將目的基因進(jìn)行精細(xì)定位。在不同的群體中，標(biāo)記之間的遺傳距離會(huì)有所變化，所以要在所研究的材料中根據(jù)已發(fā)表的資料重新對(duì)基因進(jìn)行定位。目的基因和標(biāo)記的遺傳距離應(yīng)不大于10ｃＭ，然后以標(biāo)記的基因輔助選擇。近年來，應(yīng)用分子標(biāo)記建立品種的指紋圖譜已用于品種純度的鑒定，該方法在幼苗或種子階段就可鑒定出品種純度。品種純度的鑒定可以消除同物異名、同名異物的現(xiàn)象，確定保護(hù)種質(zhì)資源遺傳完整性的最小繁種群體和最小保種量，進(jìn)行核心種質(zhì)篩選和種質(zhì)資源的分類等。9.5.2.5種質(zhì)資源及品種鑒定此外，利用相同分子標(biāo)記進(jìn)行不同物種間ＱＴＬ的比較作圖，也已在茄科（番茄、馬鈴薯、辣椒等）和十字花科（擬南芥菜、甘藍(lán)、花椰菜、油菜等）等的物種之間進(jìn)行，并從中發(fā)現(xiàn)了物種間標(biāo)記圖譜與ＱＴＬ圖譜的相似性，即發(fā)現(xiàn)了不同物種的共線性（不同物種中一致的基因位置和排序現(xiàn)象），由此可預(yù)測(cè)一些重要ＱＴＬ在不同物種中的位置，從已知物種基因來推知另一物種的同源基因的位置和功能，通過ＱＴＬ圖譜的比較追溯物種的進(jìn)化過程，并開拓新種質(zhì)資源。這對(duì)于作物的重要農(nóng)藝性狀基因克隆和分子標(biāo)記育種極為有利。隨著生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物基因組學(xué)（genomics，指對(duì)基因組作圖、測(cè)序及分析的學(xué)科，主要涉及結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)）和生物信息學(xué)（bioinformatics,涉及生物信息的獲取、處理、儲(chǔ)存、分發(fā)、分析和解釋等所有方面，以闡明和理解大量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義為目標(biāo)的一門學(xué)科）的興起，生物技術(shù)在園藝植物育種領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更廣闊，它對(duì)推動(dòng)園藝植物育種事業(yè)發(fā)展的作用將會(huì)更大。練習(xí)與思考１．什么是生物技術(shù)？２．遺傳信息是怎樣在生物上、下代之間傳遞的？３．基因工程在園藝植物育種中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在哪些方面？４．你對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性是怎樣理解的？５．細(xì)胞工程主要涉及哪些內(nèi)容？６．怎樣開展突變細(xì)胞的篩選？７．請(qǐng)簡(jiǎn)述體細(xì)胞雜交的步驟。８．請(qǐng)分析花藥培養(yǎng)與花粉（小孢子）培養(yǎng)的異同。９．請(qǐng)分析分子標(biāo)記的主要應(yīng)用。本章小結(jié)THANKS園藝植物遺傳育種第一章

緒論第二章經(jīng)典遺傳與細(xì)胞質(zhì)遺傳第三章數(shù)量遺傳第四章園藝植物種質(zhì)資源與引種馴化第五章選擇育種第六章有性雜交育種第七章雜種優(yōu)勢(shì)利用第八章誘變育種第九章現(xiàn)代生物技術(shù)育種第十章新品種的審定與推廣繁育實(shí)訓(xùn)1-15第十章新品種的審定與推廣繁育10.1品種審定10.1.1品種審定的概念10.1.2品種審定的意義10.1.3品種審定制度10.2植物新品種保護(hù)

10.2.1植物新品種保護(hù)的意義10.2.2植物新品種保護(hù)的國際和國內(nèi)現(xiàn)狀10.2.3我國植物新品種保護(hù)條例的主要內(nèi)容10.2.4植物新品種保護(hù)與品種審定的關(guān)系10.2.5觀賞植物品種的國際登錄10.3良種繁育與品種推廣

10.3.1良種繁育的概念與任務(wù)10.3.2品種的混雜、退化及對(duì)策10.3.3良種繁育的程序和方法10.3.4品種推廣

練習(xí)與思考

本章小結(jié)知識(shí)目標(biāo)●了解品種審定的概念、意義和制度，新品種保護(hù)的意義、國際國內(nèi)現(xiàn)狀、我國植物新品種保護(hù)條例的主要內(nèi)容●理解品種審定與新品種保護(hù)的關(guān)系、觀賞植物品種的國際登錄●了解良種繁育的概念和任務(wù)、良種繁育程序、品種推廣的準(zhǔn)則與方式方法●理解良種混雜、退化的現(xiàn)象及原因●掌握防止良種混雜、退化的對(duì)策，加速良種繁育的方法能力目標(biāo)●能解釋品種審定的概念、良種繁育的概念●針對(duì)客觀情況能采取有效措施防止良種混雜、退化問題10.1品種審定根據(jù)2000年12月１日我國開始實(shí)施的枟中華人民共和國種子法枠第三章第十五條和第十六條的規(guī)定：“主要農(nóng)作物品種和主要林木品種在推廣應(yīng)用前應(yīng)當(dāng)通過國家級(jí)或者省級(jí)審定，申請(qǐng)者可以直接申請(qǐng)省級(jí)審定或者國家級(jí)審定。由省、自治區(qū)、直轄市人民政府農(nóng)業(yè)、林業(yè)行政主管部門確定的主要農(nóng)作物品種和主要林木品種實(shí)行省級(jí)審定。”“通過國家級(jí)審定的主要農(nóng)作物品種和主要林木良種由國務(wù)院農(nóng)業(yè)、林業(yè)行政主管部門公告，可以在全國適宜的生態(tài)區(qū)域推廣。通過省級(jí)審定的主要農(nóng)作物品種和主要林木良種由省、自治區(qū)、直轄市人民政府農(nóng)業(yè)、林業(yè)行政主管部門公告，可以在本行政區(qū)域內(nèi)適宜的生態(tài)區(qū)域推廣；相鄰省、自治區(qū)、直轄市屬于同一適宜生態(tài)區(qū)的地域，經(jīng)所在省、自治區(qū)、直轄市人民政府農(nóng)業(yè)、林業(yè)行政主管部門同意后可以引種?！笨梢?，品種須經(jīng)審定合格并公布后，才可正式繁殖推廣。

園藝作物屬于非主要農(nóng)作物，其品種管理一般由各省級(jí)種子管理部門制定管理辦法進(jìn)行管理。目前，農(nóng)業(yè)部確定了７種農(nóng)作物，國家林業(yè)局確定了２００多個(gè)樹種，必須通過國家級(jí)或省級(jí)審定。除了強(qiáng)制要求通過審定的農(nóng)作物品種或林木品種外，其他農(nóng)作物或林木品種均屬于非強(qiáng)制性審定要求，申請(qǐng)人既可申