基因芯片技術(shù)課件

1生物芯片簡(jiǎn)介及分類(lèi)2基因芯片制備及應(yīng)用第一節(jié)生物芯片簡(jiǎn)介及分類(lèi)

二、生物芯片的分類(lèi)微矩陣芯片：將用PCR或化學(xué)合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用針點(diǎn)或噴點(diǎn)方法直接排列到玻片等載體，從而制備成芯片。特點(diǎn)是密度高、制作方便。電定位芯片：是利用靜電吸附的原理將DNA快速定位在硅基質(zhì)、導(dǎo)電玻璃上，從而制備成芯片。特點(diǎn)是在電力推動(dòng)下可使雜交快速進(jìn)行，但制作工藝復(fù)雜，點(diǎn)樣密度低?；蛐酒s交結(jié)果圖蛋白質(zhì)芯片(proteinchip):就是選擇一種能夠牢固地結(jié)合蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)的固相載體，在上面按預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定大量蛋白質(zhì)(抗原或抗體)，形成蛋白質(zhì)的微陣列，然后加入與之特異性結(jié)合的帶有特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)，通過(guò)對(duì)標(biāo)記物的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗原抗體的互檢。(四)按芯片的使用功能分類(lèi)測(cè)序芯片、表達(dá)譜芯片、基因差異表達(dá)分析芯片第二節(jié)基因芯片制作及應(yīng)用二、基因芯片的基本原理基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray三、基因芯片的制備ComparisonofDNAChipTechnology

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip8nor20n<2,000n>50,000n

sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis（一）芯片的制備基因芯片種類(lèi)較多，主要以玻璃片、硝酸纖維素膜或硅片為載體，制備方法基本上可分為兩大類(lèi)－原位合成和預(yù)合成后點(diǎn)樣。預(yù)合成后點(diǎn)樣：是指制備芯片微陣列前，要固定的探針已經(jīng)合成好，點(diǎn)樣系統(tǒng)需要做的就是把這些合成好的樣品涂在基體上。原位合成：是指利用光導(dǎo)合成的方法在載體表面上逐個(gè)合成寡核苷酸，合成后點(diǎn)樣可能將十幾至幾十個(gè)堿基的寡核苷酸或幾百個(gè)堿基的cDNA片段固定到載體上制成寡核苷酸芯片或cDNA微陣列。1支持物的預(yù)處理載體材料要求：載體表面必須具有可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性基團(tuán)，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)。使單位載體上結(jié)合的生物分子達(dá)到最佳容量。載體應(yīng)當(dāng)是惰性的和有足夠的穩(wěn)定性，包括機(jī)械的、物理的和化學(xué)的穩(wěn)定性。惰性:是指載體的其他性能或特異性吸附都不應(yīng)該干擾生物分子的功能。穩(wěn)定性:是指在進(jìn)行分子雜交或結(jié)合時(shí)，可能遭受一定的壓力或酸、堿條件而不發(fā)生變化。支持物的預(yù)處理實(shí)性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需進(jìn)行預(yù)處理,使其表面衍生出羥基、氨基活性基團(tuán)。膜性材料：聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維膜,通常包被氨基硅烷或多聚賴(lài)氨酸。2芯片的制作目前常用的基因芯片制作方法：接觸點(diǎn)樣法、噴墨法、原位合成法。接觸點(diǎn)樣法：是將樣品直接點(diǎn)在基體上，其優(yōu)點(diǎn)是儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、容易研制，是一種快速、經(jīng)濟(jì)、多功能的儀器，可以在3.6cm2面積內(nèi)點(diǎn)上10000個(gè)cDNA。不足之處是每個(gè)樣品都必須合成好、經(jīng)過(guò)純化、事先保存的。噴墨法:是以定量供給的方式，通過(guò)壓電晶體或其他推進(jìn)形式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻璃載體上。同樣需要合成好的純樣品，包括cDNA、染色體DNA片段和抗體。在1cm2面積上可噴射10000個(gè)點(diǎn)。（二）樣品的準(zhǔn)備樣品的分離純化：DNA,mRNA擴(kuò)增：PCR,RT—PCR，固相PCR探針的標(biāo)記：已克隆的基因片段、PCR，RT-PCR擴(kuò)增的基因片段、人工合成的DNA片段，單鏈、雙鏈、DNA或RNA均可作為探針。熒光標(biāo)記（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性標(biāo)記,通常是在待測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中實(shí)現(xiàn)對(duì)探針的標(biāo)記。對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平的芯片,一般需要從細(xì)胞和組織中提取RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,并加入偶聯(lián)有標(biāo)記物的dNTP,從而完成對(duì)探針的標(biāo)記過(guò)程。

探針的固化：打印探針后，需要將其固定在支持物表面，同時(shí)也要封閉支持物上未打印區(qū)域以防止核酸樣品的非特異性固定。(三)分子雜交該反應(yīng)是指標(biāo)記的樣品與芯片上的靶基因進(jìn)行雜交，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的過(guò)程。

與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成,可同時(shí)平行檢測(cè)許多基因序列。影響雜交反應(yīng)的因素：靶分子的濃度、探針濃度、靶分子和探針的序列組成、鹽濃度、雜交溫度和反應(yīng)時(shí)間、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等。(四)信號(hào)檢測(cè)與結(jié)果分析芯片經(jīng)雜交反應(yīng)后，各反應(yīng)點(diǎn)形成強(qiáng)弱不同的光信號(hào)圖像，用芯片掃描儀和相關(guān)軟件加以分析，即可獲得有關(guān)的生物信息。如果是用同位素標(biāo)記靶基因，其后的信號(hào)檢測(cè)即是放射自顯影；若用熒光標(biāo)記，則需要一套熒光掃描及分析系統(tǒng)，對(duì)相應(yīng)探針陣列上的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析比較，得到待測(cè)樣品的相應(yīng)信息?；蛐酒瑨呙杞Y(jié)果不同的顏色代表一個(gè)探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅〉黃〉綠〉蘭〉紫信號(hào)檢測(cè)與結(jié)果分析激光激發(fā)使含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各雜交點(diǎn)的信號(hào)軟件進(jìn)行進(jìn)行圖象分析和數(shù)據(jù)處理

GenomicDNA四、基因芯片的特點(diǎn)五、基因芯片的應(yīng)用進(jìn)一步闡明基因的相互協(xié)同、抑制、互為因果等關(guān)系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，并從已知生物學(xué)功能的基因推論未報(bào)道基因的生物學(xué)意義。同時(shí)，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達(dá)譜芯片的研究。基因型及多態(tài)性分析：利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價(jià)固定于玻璃載片上，采用PCR擴(kuò)增基因組DNA，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈，將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交，通過(guò)熒光掃描檢測(cè)雜交模式，即可測(cè)定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性，該方法對(duì)人的酪氨酸酶基因第4個(gè)外顯子內(nèi)含有的5個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析，結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。基因芯片測(cè)序流程疾病的診斷與治療：尋找和檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因及在RNA水平上檢測(cè)致病基因的表達(dá)基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，它可以在一張芯片同時(shí)對(duì)多個(gè)病人進(jìn)行多種疾病的檢測(cè)；無(wú)需機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能及早診斷，待測(cè)樣品用量??；能檢測(cè)病原微生物的耐藥性，病原微生物的亞型；極高的靈敏度和可靠性；檢測(cè)成本低，自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。這些特點(diǎn)使得醫(yī)務(wù)人員在短時(shí)間內(nèi)，可以掌握大量的疾病診斷信息，這些信息有助于醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)找到正確的治療措施。

在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：在環(huán)境保護(hù)上，基因芯片也廣泛的用途，一方面可以快速檢測(cè)污染微生物或有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境、人體、動(dòng)植物的污染和危害，同時(shí)也能夠通過(guò)大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。

本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容第一節(jié)、基因芯片一、什么是基因芯片（Genechip）

1、

所謂基因芯片是指將大量探針以很的高密度分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的核酸樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量，也可還可以用于核酸樣品的序列分析。

基因芯片雜交結(jié)果圖常用的待測(cè)分子PCR產(chǎn)物：序列分析RT-PCR產(chǎn)物：基因表達(dá)分析基因芯片使用步驟芯片制作把探針固定于載體表面樣品處理目標(biāo)分子富集分子間的雜交結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析第二節(jié)、基因芯片的制作基因芯片的制作方式原位合成直接點(diǎn)樣光引導(dǎo)原位合成分子印章法分子印章法針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣一、針式點(diǎn)樣1、玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團(tuán)。2、點(diǎn)樣針沾取探針溶液。3、點(diǎn)樣針把探針點(diǎn)到玻片表面，讓探針末端的化學(xué)集團(tuán)與玻片表面的集團(tuán)形成共價(jià)鍵。4、針式點(diǎn)樣的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：成本低，操作簡(jiǎn)單，密度高（幾千-幾十萬(wàn)點(diǎn)/cm2)，轉(zhuǎn)移過(guò)程中探針溶液損失小。缺點(diǎn)：定量準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性不好2202芯片點(diǎn)樣儀

生產(chǎn)商Bio-Rad

性能介紹分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)，重復(fù)性：3um

球面精確性：l0um。

一次制成芯片數(shù)：126塊芯片每塊玻片點(diǎn)樣量>82,000個(gè)點(diǎn)

二、噴墨點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣的方式類(lèi)似于噴墨打印機(jī)。將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動(dòng)控制打印噴頭在芯片支持物上移動(dòng)，并根據(jù)芯片不同位點(diǎn)探針序列需要將特定的探針試劑（不足納升）噴印到特定位點(diǎn)。噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。第三節(jié)、基因芯片的使用流程以HLA基因多態(tài)性為例一、待測(cè)分子的獲得與標(biāo)記

1）提取患者基因組DNA

2）DNA樣品PCR擴(kuò)增并進(jìn)行標(biāo)記。常用標(biāo)記物為熒光素。1.末端標(biāo)記：在引物上標(biāo)記有熒光素，在DNA擴(kuò)增過(guò)程時(shí)，使新形成的DNA鏈末端帶有熒光素。

2.隨機(jī)插入：選擇四種緘機(jī)基，使其中一種或幾種掛有熒光素，在PCR過(guò)程中，帶有熒光素的堿基和不帶熒光探針的堿基，同時(shí)參與DNA鏈的形成。二、雜交過(guò)程類(lèi)似于一般的雜交法。把要雜交的分子的溶液覆蓋芯片的探針，用蓋玻片覆蓋，即可雜交。雜交溫度的選擇極關(guān)鍵。芯片雜交爐

（Hybridizationoven)

生產(chǎn)商Affymetrix

全自動(dòng)控制芯片的雜交過(guò)程。溫度控制精確，芯片艙的轉(zhuǎn)動(dòng)提供充分的混合。該雜交爐可以同時(shí)處理64張芯片。

三、基因芯片的掃描

基因芯片雜交結(jié)果要用專(zhuān)用的掃描系統(tǒng)讀取。BBACDE放大器數(shù)模轉(zhuǎn)換器計(jì)算機(jī)A:激光器B:濾光片C:二色鏡D:反光鏡E:關(guān)柵

ScannerArrayScannerArray掃描儀采用氬離子激光器來(lái)激發(fā)與目的DNA結(jié)合的熒光分子來(lái)產(chǎn)生定量的雜交信號(hào)。ScannerArray掃描儀掃描芯片上成千上萬(wàn)的探針。掃描的同時(shí)給出高分辨率的實(shí)時(shí)的圖像，同時(shí)熒光亮度的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在原始文件中。激光源:

488nm氬離子激光器

激光束直徑：3微米

檢測(cè)指標(biāo)：

樣品點(diǎn)直徑：20微米

支持的染料：熒光素

分辨率：3微米

預(yù)掃描時(shí)間：最長(zhǎng)2分單次掃描時(shí)間：最長(zhǎng)4分鐘（12.8mmx12.8mm）基因芯片掃描結(jié)果不同的顏色代表一個(gè)探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅〉黃〉綠〉蘭〉紫四、結(jié)果分析當(dāng)從芯片發(fā)出的熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)字輸出后，數(shù)據(jù)文件就被定量和翻譯，通過(guò)重疊芯片像線(xiàn)柵，軟件對(duì)芯片上的每個(gè)點(diǎn)計(jì)算平均密度值，從而完成定量，通過(guò)對(duì)芯片上實(shí)驗(yàn)點(diǎn)和對(duì)照點(diǎn)的比較，選出雜交點(diǎn)，并定量。

GenomicDNA基因芯片具有什么優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)？4、生物芯片的優(yōu)點(diǎn)1）高通量性：可同時(shí)并行分析成千上萬(wàn)種分子。節(jié)省時(shí)間。2）微型化，實(shí)驗(yàn)所需試劑用量少3）高度自動(dòng)化5、缺點(diǎn)：在同一溫度下雜交，不同探針雜交效率不同。生物芯片于一般分子雜交比較生物芯片Southern等信息通量高，幾千-幾十萬(wàn)點(diǎn)/cm2低自動(dòng)化程度高低研究的速度快慢實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平行性好低第四節(jié)、基因芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用一、基