慢病毒包裝操作方案

慢病毒包裝操作方案?一、引言慢病毒載體是一種高效的基因傳遞工具，在基因治療、細(xì)胞生物學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。本操作方案旨在詳細(xì)介紹慢病毒包裝的實(shí)驗(yàn)流程，確保實(shí)驗(yàn)人員能夠準(zhǔn)確、規(guī)范地進(jìn)行慢病毒包裝操作，獲得高質(zhì)量的慢病毒顆粒。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（一）實(shí)驗(yàn)材料1.細(xì)胞系：用于包裝慢病毒的細(xì)胞系，如293T細(xì)胞等，應(yīng)選擇生長狀態(tài)良好、無污染的細(xì)胞。2.載體質(zhì)粒：包含目的基因的慢病毒載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒（如psPAX2）和包膜質(zhì)粒（如pMD2.G）。3.試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素鏈霉素溶液、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑、氯喹、聚乙二醇（PEG）8000、甘油、PBS緩沖液等。4.儀器設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、移液器、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、倒置顯微鏡等。

（二）溶液配制1.DMEM完全培養(yǎng)基：在DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液。2.0.25%胰蛋白酶EDTA溶液：稱取0.25g胰蛋白酶和0.02gEDTA，加入100mlPBS緩沖液，過濾除菌后保存于4℃。3.2×HBS溶液：稱取1.6gNaCl、0.074gKCl、0.37gNa?HPO?·2H?O、1g葡萄糖，加入80ml雙蒸水溶解，用1MHCl調(diào)節(jié)pH至7.12，定容至100ml，過濾除菌后保存于4℃。4.磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑溶液：稱取2.5mg磷酸鈣，加入1ml雙蒸水，渦旋振蕩使其溶解，逐滴加入2MCaCl?溶液至1.25ml，邊加邊渦旋，室溫放置30分鐘后使用。

三、細(xì)胞培養(yǎng)（一）293T細(xì)胞復(fù)蘇1.從液氮中取出凍存的293T細(xì)胞，迅速放入37℃水浴中，輕輕晃動(dòng)使其快速融化。2.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，加入5mlDMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻。3.1000rpm離心5分鐘，棄上清。4.用適量DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）細(xì)胞傳代1.當(dāng)293T細(xì)胞密度達(dá)到80%90%時(shí)，進(jìn)行傳代。2.吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞12次。3.加入適量0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化12分鐘，待細(xì)胞變圓后，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。4.用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。5.1000rpm離心5分鐘，棄上清。6.用適量DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:31:5的比例接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（三）細(xì)胞凍存1.當(dāng)293T細(xì)胞密度達(dá)到80%90%時(shí)，進(jìn)行凍存。2.吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞12次。3.加入適量0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化12分鐘，待細(xì)胞變圓后，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。4.用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。5.1000rpm離心5分鐘，棄上清。6.用細(xì)胞凍存液（90%胎牛血清+10%DMSO）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?1×10?個(gè)/ml。7.將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1ml，置于程序降溫盒中，先于80℃冰箱過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

四、慢病毒包裝（一）轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備1.轉(zhuǎn)染前一天，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到60%70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2.計(jì)算所需的載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒的用量，按照一定比例混合（如目的基因載體質(zhì)粒:psPAX2:pMD2.G=2:1.5:0.5），加入適量無血清DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻。

（二）磷酸鈣轉(zhuǎn)染1.在上述質(zhì)?；旌弦褐兄鸬渭尤肓姿徕}轉(zhuǎn)染試劑溶液，邊加邊輕輕渦旋，室溫放置1520分鐘，使其形成磷酸鈣質(zhì)粒沉淀。2.將磷酸鈣質(zhì)粒沉淀逐滴加入到6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使沉淀均勻分布于細(xì)胞表面。3.將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46小時(shí)。4.棄去細(xì)胞培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，每孔加入2ml含100μM氯喹的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)46小時(shí)。5.棄去含氯喹的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞23次，然后加入2mlDMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（三）收集病毒上清1.轉(zhuǎn)染后4872小時(shí)，觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。2.將細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，去除細(xì)胞碎片。3.將上清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，0.45μm濾器過濾，去除細(xì)菌和支原體污染，得到粗制病毒上清液。

（四）病毒濃縮1.在粗制病毒上清液中加入PEG8000，使其終濃度達(dá)到8%，輕輕混勻，置于4℃冰箱過夜沉淀病毒。2.次日，4℃、12000rpm離心30分鐘，棄上清。3.用適量PBS緩沖液重懸病毒沉淀，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。4.再次4℃、12000rpm離心30分鐘，棄上清。5.用適量PBS緩沖液重懸病毒沉淀，得到濃縮后的病毒液，保存于80℃冰箱備用。

五、病毒滴度測(cè)定（一）實(shí)驗(yàn)原理采用熒光定量PCR法測(cè)定慢病毒滴度，通過檢測(cè)病毒感染細(xì)胞后基因組中特定基因的拷貝數(shù)，結(jié)合感染細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算出病毒滴度。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟1.細(xì)胞接種：將293T細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。2.病毒稀釋：將濃縮后的病毒液進(jìn)行梯度稀釋，一般設(shè)置10?110??等不同稀釋度。3.病毒感染：每孔加入不同稀釋度的病毒液100μl，同時(shí)設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。4.細(xì)胞收獲：48小時(shí)后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞23次。5.DNA提?。喊凑誅NA提取試劑盒的說明書提取細(xì)胞基因組DNA。6.熒光定量PCR：以提取的細(xì)胞基因組DNA為模板，采用針對(duì)慢病毒載體特定基因的引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件按照熒光定量PCR試劑盒的說明書進(jìn)行設(shè)置。7.結(jié)果分析：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同稀釋度病毒感染細(xì)胞后基因組中特定基因的拷貝數(shù)，結(jié)合感染細(xì)胞的數(shù)量，通過公式計(jì)算病毒滴度。病毒滴度（TU/ml）=（C×V）/（N×D），其中C為熒光定量PCR檢測(cè)到的病毒基因拷貝數(shù)，V為病毒感染細(xì)胞時(shí)加入的病毒液體積（ml），N為感染病毒的細(xì)胞數(shù)量，D為病毒稀釋倍數(shù)。

六、注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)操作過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止細(xì)胞污染。2.各種試劑的配制應(yīng)準(zhǔn)確無誤，特別是磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑溶液的配制，要注意試劑的純度和pH值。3.轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)注意磷酸鈣質(zhì)粒沉淀的形成和加入細(xì)胞的方式，避免沉淀不均勻或?qū)?xì)胞造成損傷。4.病毒包裝過程中，細(xì)胞狀態(tài)的觀察至關(guān)重要，及時(shí)收集病毒上清，確保病毒