（高清版）DB12∕T 838-2018 辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法　　

辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法2018-11-07發(fā)布天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、呂敬剛、趙新、王成、蘭璞、焦荻、高素燕、陳銳、關(guān)海濤、張耀中、焦賀敏。1準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣由幾個核苷酸(1～6個)為重復(fù)單位聚集而成的長達(dá)幾十個至幾百個bp(一般為100～200)的串聯(lián)2微量加樣器；磁力攪拌器；臺式離心機(jī)；紫外-可見成像系統(tǒng)；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2);三羥甲基氨基甲烷(Tris);鹽酸(HCl,36%);十二烷基硫酸雙丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；親和硅烷；剝離硅烷；無水乙冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液(37%);TaqDNA聚合酶(含Mg2的10×PCR緩沖液);四種脫氧核糖核苷酸 覆蓋一層紗布，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為16h35℃光照培養(yǎng)，8h28℃暗培養(yǎng)，待種子長出子葉到65℃,每管放入400μL混合樣品，將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中，保溫30min后取下，向3用22對核心引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增雙親及送檢樣品各10份DNA,篩選帶型清晰，雙親間差異大，互補(bǔ)性好的引物作為純度鑒定的SSR分子標(biāo)記。6.4PCR擴(kuò)增6.4.1反應(yīng)體系總體積10μL,包括5μL超純水、1μL含Mg2的10×PCR0.6μLSSR引物(10μmol/L)、1μLTaqDNA聚合酶(2.5U/μL)、1μL混勻。6.4.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min;94℃變性45s,按附錄B推薦的引物退火溫度退火45s,72℃延伸45s,循環(huán)35次；72℃延伸10min;-20℃保存?zhèn)溆谩?.5變性聚丙烯酰氨凝膠電泳按照附錄C規(guī)定的方法，進(jìn)行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。7純度計算以篩選出來的SSR分子標(biāo)記為引物擴(kuò)增送檢樣品的DNA,通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示純度，計算公式如下：4(規(guī)范性附錄)溶液配制A.1DNA提取液含有200mmol/LTris-HC1(pH8.0),250mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA,0.5%SDS,經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用。A.2引物稀釋按照引物合成單的說明先配制100μmol/L的儲存液，取適量儲存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。A.36×變性上樣緩沖液去離子甲酰胺49mL,0.5mol/L的EDTA溶液(pH8.0)1mL,溴酚藍(lán)0.125g,二甲苯青0.125g。A.410×電泳緩沖液Tris108g,硼酸55g,0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液37mL,定容至1000mL。A.540%丙烯胺膠丙烯酰胺190g,甲叉雙丙烯酰胺10g,定容至500mL。A.6A.64.5%丙烯胺膠尿素450g,10×電泳緩沖液100mL,40%丙烯酰胺膠112.5mL,定容至1000mL。20μL親和硅烷，20μL冰醋酸，加無水乙醇至2mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。A.82%剝離硅烷0.1g過硫酸銨溶于1mL超純水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。5A.10固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。A.11染色液4g硝酸銀，定容至2000mL。A.12顯影液2000mL蒸餾水中加入40g氫氧化鈉和10mL甲醛。6(規(guī)范性附錄)22對核心引物22對核心引物見表B.1。表B.122對核心引物表序號引物引物序列(5'—3')退火溫度℃擴(kuò)增片段大小范圍(bp)12F:CGCATCTACATCAAGAAT345F:TGCGAGTACCGAGTTCT6789F:TCCAAACTACAAGCCTGCR:TTTTGCATTATTGAGTCR:TGATCCCTTCTTGTTTGF:TTTTGGGGTTCAATAAAR:GACAATGTTGAAAAAGGT7膠80mL,加入TEMED80μL和10%過硫酸銨400μL,迅速混勻后灌膠。灌膠過程中防止氣泡產(chǎn)生。灌在20μLPCR產(chǎn)物中加入4μL6×變性上樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序：95℃變性5min,4℃冷卻10min。用洗耳球吹洗加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)。每個加樣孔加入5μL變性后的PCR產(chǎn)物。80W恒功率電泳至上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板的中部。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠緊