病毒蝕斑技術(shù)

病毒蝕斑技術(shù)

1952年，Dulbecco把噬菌體空斑技術(shù)應(yīng)用于動物病毒學(xué)，從而使病毒蝕斑技術(shù)(Virusplaqueformation)成為許多病毒的滴定和研究方法。

(一)原理病毒感染細(xì)胞后，由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過幾個(gè)增殖周期，便形成一個(gè)局限性病變細(xì)胞區(qū)，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個(gè)蝕斑是由最初感染細(xì)胞的一個(gè)病毒顆粒形成的，因而該項(xiàng)技術(shù)常用于病毒顆粒計(jì)數(shù)和分離病毒克隆。但在實(shí)際操作中，常出現(xiàn)幾個(gè)病毒顆粒同時(shí)感染一個(gè)細(xì)胞的情況，影響滴定的準(zhǔn)確性和克隆的純一性，為此，接種的病毒液要充分分散和稀釋。對于細(xì)胞結(jié)合性病毒，如MDV，需用單層細(xì)胞；對細(xì)胞釋放性病毒，即可用固相介質(zhì)懸浮的細(xì)胞，也可用單層細(xì)胞，但后者需用瓊脂等固體介質(zhì)蓋在細(xì)胞上，以防釋放的病毒在液體介質(zhì)中流動。固體介質(zhì)的濃度由病毒的大小而定，大病毒用濃度較低的介質(zhì)，小病毒用濃度較高的介質(zhì)，以便將蝕斑的生長速度控制在適宜的范圍內(nèi)。小蝕斑需用顯微鏡觀察，1-10mm的大蝕斑可用肉眼計(jì)數(shù)。為便于肉眼觀察，常用中性紅等染料染色。因病變細(xì)胞不吸收中性紅，病變細(xì)胞區(qū)便呈現(xiàn)無色蝕斑。病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位(PFU/ml)來表示。例如，3個(gè)細(xì)胞瓶的平均蝕斑是58，接種量為0.2ml，病毒的稀釋度為2.5×103，則病毒原液的滴度為：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)

(二)技術(shù)應(yīng)用蝕斑技術(shù)可以應(yīng)用于分離病毒的克隆(無性繁殖純系)、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態(tài)和大小研究病毒的生物學(xué)特性。

1.病毒生物學(xué)純化(Virusbiologicalpurification)在進(jìn)行血清中和試驗(yàn)時(shí),常常會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)病毒株的滴度下降，因而影響了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,這種情況多見于蟲煤病毒。這可能是由于原始毒種的混雜,或者已有許多變異病毒粒子存在其中,甚至出現(xiàn)數(shù)量眾多的缺陷病毒所致。這時(shí),有必要把手上掌握的標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行純化,應(yīng)用病毒蝕斑技術(shù),挑選出各個(gè)不同的純化病毒,亦稱“克隆株”。克隆后的病毒經(jīng)在敏感細(xì)胞上增殖,測定其滴度,選用合適的毒株用于血清中和試驗(yàn)。為了更有效地進(jìn)行純化,必須在覆蓋營養(yǎng)瓊脂之前用營養(yǎng)液洗去單層細(xì)胞上未被吸附的病毒。同時(shí)要控制好稀釋的濃度,一個(gè)培養(yǎng)瓶中的蝕斑數(shù)目最好不超過10個(gè)，挑取在其附近10mm都是健康細(xì)胞的蝕斑。挑取后的病毒應(yīng)傳兩代或兩代以上。一般認(rèn)為，中性紅染料會由于“光敏”作用而抑制病毒蝕斑的形成和破壞宿主細(xì)胞。因此，加了中性紅覆蓋層的培養(yǎng)物應(yīng)在暗處培養(yǎng)。

2.蝕斑減少中和試驗(yàn)(PlaqueReductionNeutralizationTest)蝕斑減少中和試驗(yàn)是檢測血清中和抗體的一種敏感性較高的方法，試驗(yàn)以使蝕斑數(shù)減少50％的血清稀釋度作為其中的效價(jià)。試驗(yàn)使用定量的病毒(100PFU)與不同稀釋度的等量血清混合后感作,接種預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細(xì)胞,再覆蓋上營養(yǎng)瓊脂置37℃

1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或純化

(1)于55mm直徑的滅菌塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)綠猴腎細(xì)胞(Vero)，使形成單層。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間約3－4天，接種量約為2000000/ml個(gè)細(xì)胞。選取單層細(xì)胞全部覆蓋，不留有空洞的培養(yǎng)皿用作試驗(yàn)。

(2)用細(xì)胞培養(yǎng)液對AKV病毒作10倍倍比稀釋至10-7并保存于4℃。

(3)每個(gè)稀釋度的病毒液接種3個(gè)平皿。

(4)接種前棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用5mlPBS或細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗單層細(xì)胞,然后棄去沖洗液。

(5)每個(gè)平皿分別加入0.2ml病毒稀釋液，對照組只用細(xì)胞培養(yǎng)液代替，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱吸附一小時(shí)，每15分鐘搖動一次，以便使病毒均勻分布。

(6)按第4步驟沖洗未被吸附的病毒。

(7)取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的1.5％瓊脂(預(yù)熱)中，每個(gè)平皿加入7ml，置平臺待冷卻凝固后于37℃3%碳酸氫鈉2.4ml

雙蒸水32.8ml

40ml

(2)兩倍濃縮細(xì)胞營養(yǎng)液(配制首層瓊脂用)10倍199保存液20ml

牛血清4ml

3％碳酸氫鈉12ml

1％二乙氨基乙基(DEAE)10ml(可選擇)

雙蒸水54ml100ml(置40－45℃

精制瓊脂糖1.5g

雙蒸水加至100ml

(0.112MPa高壓滅菌15分鐘，置40－45℃水浴備用。)

(4)含中性紅兩倍濃縮細(xì)胞營養(yǎng)液(配制第二層瓊脂用)

10倍199保存液20ml

牛血清10ml

3％碳酸氫鈉12ml

0.5％中性紅6ml

雙蒸水52ml

100ml

(置40－45

精制瓊脂糖2g

雙蒸水加至100ml

(0.112MPa高壓滅菌15分鐘，置40－45℃（6）結(jié)晶紫溶液配置：Crystalvioletstain:stock=1g.crystalviolet

99ml20%EtOH

workingsoluion=20mlstock

40ml95%EtOH

150mldistilledwater---------------------------------------------------------------------------

Crystalviolet-Formaldehydestain:100ml10ml37-40%formalin

90mldH2O

0.4gNaH2PO4(monobasic)

0.65gNa2HPO4(dibasic)

0.1gcrystalviolet計(jì)數(shù)：Pfu/ml(oforiginalstock)=1/dilutionfactorxnumberofplaquesx1/(mlofinoculum/plate)

----------------------------------EV71Plaqueassay.

RDcells(1×105)in200μlRPMI1640wereseededineachwellofa24-wellplate.Serialdilutionsofthedifferentviralsuspensionswereaddedtothewellsfor18hofincubation.Afterabsorptionfor1hat37°C,thevirussupernatantwasreplacedwithDMEMcontaining2%FBSand0.8%methylcellulosefor72h.Aftertheremovalofthemediumanda15-minfixationstepwith4%formalininPBS,theplaqueswerereadbybeingstainedwith1%crystalviolet.CountswereexpressedasPFUpermilliliter.我也用Viscousmedium做病毒空斑實(shí)驗(yàn)，甲基纖維素覆蓋培養(yǎng)液具體配方如下，供參考：Inaglassbottle,combine8.8gmethylcellulose(4000centipoise,Sigma)with320mldistilledwater.Stirwithalargemagneticstirrer.Autoclave30minat121℃,leavingthemagneticstirrerinsidethebottle.Removefromautoclavewhilestillhotandstiragainuntilmethylcellulosehascompletelydissolved(usuallyafewhours).Add40ml10×MEMor10×DMEM,40mlFBS,40,000Upenicillin,40mgstreptomycin,and4mlof1MHEPES.AddL-glutamine