生物化學 Chapter 3 蛋白質(zhì)

Chapter3

蛋白質(zhì)(protein)

1提綱第一部分蛋白質(zhì)的共價結構第二部分蛋白質(zhì)的三維結構第三部分蛋白質(zhì)的結構與功能的關系第四部分蛋白質(zhì)性質(zhì)與分離純化2蛋白質(zhì)存在于所有的生物細胞中，是生命活動的物質(zhì)基礎和功能執(zhí)行者，幾乎參與了所有的生命活動過程。氨基酸是蛋白質(zhì)的構件分子，20種如此簡單的氨基酸如何組成如此數(shù)量巨大、種類繁多、構象各異的蛋白質(zhì)，從而構建色彩紛繁的生命世界？

(1)蛋白質(zhì)中氨基酸序列？

(2)維持蛋白質(zhì)構象的作用力？

(3)砌塊耦合？3Section1蛋白質(zhì)的共價結構蛋白質(zhì)通論肽與肽鍵蛋白質(zhì)一級結構蛋白質(zhì)一級結構與功能的關系4一、蛋白質(zhì)通論1、蛋白質(zhì)定義

蛋白質(zhì)是由天然氨基酸通過肽鍵連接而成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質(zhì)量、復雜的分子結構和特定的生物功能，是表達生物遺傳性狀的一類主要物質(zhì)。

2、蛋白質(zhì)在生命中的重要性蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎；生命是物質(zhì)運動的特殊形式，是蛋白質(zhì)的存在方式；這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)與其外部自然界不斷的新陳代謝。5

蛋白質(zhì)是生命機體的重要組成成分蛋白質(zhì)占干重人體中（中年人）人體45%水55%

細菌50%-80%蛋白質(zhì)19%

真菌14%-52%脂肪19%

酵母菌14%-50%糖類＜1%

白地菌50%無機鹽7%蛋白質(zhì)是一種生物功能的主要體現(xiàn)者

（1）酶的催化作用（2）調(diào)節(jié)作用(多肽類激素)

（3）運輸功能（4）運動功能（5）免疫保護作用(干擾素)

（6）接受、傳遞信息的受體（7）毒蛋白外源蛋白質(zhì)有營養(yǎng)功能，可作為生產(chǎn)加工的對象.

63、蛋白質(zhì)組成（1）元素組成蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物，除氮外，主要含有碳、氫、氧和少量的硫，某些蛋白質(zhì)還含磷、鐵、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為碳50％、氫7％、氧23％、氮16%、硫0-3％、其他微量；大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量。（2）化學組成（兩種類型）單純蛋白質(zhì)：水解為α-氨基酸，對不含輔基的蛋白質(zhì)，

氨基酸大約數(shù)目=蛋白質(zhì)分子量/110結合蛋白質(zhì)=單純蛋白質(zhì)+輔基74、蛋白質(zhì)分類（1）依據(jù)蛋白質(zhì)構象分類

球狀蛋白質(zhì)（globularprotein）：外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)：分子類似纖維或細棒，又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。（2）依據(jù)蛋白質(zhì)組成分類A、簡單蛋白(simpleprotein)

：又稱為單純蛋白質(zhì)，只含由

-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。清蛋白（albumin）和球蛋白（globulin）：廣泛存在于動物組織中，清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水、易溶于稀酸。谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿，后者可溶于70－80％乙醇中。8精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在于細胞核中；硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白等。B、結合蛋白(conjugatedprotein)：由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成。色蛋白：簡單蛋白與色素結合，如血紅蛋白和細胞色素。糖蛋白：簡單蛋白與糖類結合，如細胞膜中的糖蛋白；脂蛋白：簡單蛋白與脂類結合，如血清脂蛋白；核蛋白：簡單蛋白與核酸結合，如細胞核中核糖核蛋白。磷蛋白：簡單蛋白與磷酸結合，如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。95、蛋白質(zhì)含量測定（1）凱氏定氮法(經(jīng)典測氮法)優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法簡便；缺點：易將無機氮都歸入蛋白質(zhì)中,不精確。計算：蛋白質(zhì)含氮量平均16%，取其倒數(shù)100/16=6.25，即為蛋白質(zhì)換算系數(shù)，其含義是1g元素氮相當于6.25g蛋白質(zhì)；

蛋白質(zhì)含量=含氮量×6.25（2）其它方法：紫外比色法、雙縮脲法、Folin—酚、考馬斯亮蘭G—250比色法等；（3）測定條件：蛋白質(zhì)必須是可溶。10例題1：血紅蛋白含0.335%的鐵,計算血紅蛋白最少相對分子量；用物理方法測定血紅蛋白真實分子量為66KDa，問血紅蛋白含幾個鐵原子？【解】每個血紅蛋白分子至少含1個鐵原子，鐵的摩爾質(zhì)量（原子量）為55.85g/mol,即1mol血紅蛋白應含55.85g，另外已知血紅蛋白含0.335%的鐵

100g蛋白/0.335g鐵=M最少/55.85g鐵

M最少=100×55.85/0.335=16672Da

鐵原子數(shù)目=66000/16672=4

若1個亞基含1個鐵原子，則血紅蛋白由4個亞基組成11二、肽(peptide)與肽鍵

蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結合而成的生物大分子；蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。1、肽一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基；在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序；通常在多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的

-羧基，稱為羧基端或C-端；12

氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為：

NH3+-Ser-Val-Tyr-Asp-Gln-COO-132、肽鍵的平面結構

順式構型中的兩個Cα彼此接近，引起各R基之間的空間位阻，造成結構不穩(wěn)；在反式構型中兩者相距較遠，結構比較穩(wěn)定。肽鏈中的肽鍵在大多數(shù)情況下，以反式結構存在(脯氨酸例外),空間位阻較少。

143、肽鍵共振

肽鍵是一種酰胺鍵，通常在羰基碳和酰胺氮之間是單鍵，這樣肽鏈主鏈上的3種鍵（Cα-C鍵，C-N肽鍵，N-Cα鍵）都是單鍵，所以原則上多肽主鏈上的任何共價鍵都可發(fā)生旋轉,但酰胺氮和羰基氧之間會發(fā)生共振相互作用，肽鍵共振的結果:(1)阻繞肽鍵C-N的自由旋轉，只保留N-Cα鍵和Cα-C鍵的旋轉；(2)組成肽基的4個原子和2個相鄰的Cα原子傾向于共平面，形成多肽主鏈的酰胺平面。154.肽鍵特點肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用;組成肽鍵的4個原子和2個相鄰的Cα處于同一平面，肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉。肽鍵中C-N鍵長0.132nm,而通常C-N單鍵0.147nm、C=N鍵0.127nm

165.天然存在的重要多肽

在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位；但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽；谷胱甘肽、腦啡肽、激素類多肽、抗生素類多肽、蛇毒多肽等。17

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-腦啡肽18GluCysGly還原型谷胱甘肽19還原型谷胱甘肽（GSH）是人類細胞質(zhì)中自然合成的一種肽，它是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝。GSH能激活多種酶[如巰基(-SH)酶等]，促進糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝，并能影響細胞的代謝過程；如通過轉甲基及轉丙氨基反應，GSH能保護肝臟的合成、解毒、滅活激素等，促進膽酸代謝，有利于消化道吸收脂肪及脂溶性維生素（A、D、E、K）。通過巰基與體內(nèi)的自由基結合，轉化成易代謝的酸類，加速自由基的排泄，有助于減輕化療、放療的毒副作用，保護正常組織器官。對于貧血、中毒或組織炎癥造成的低氧血癥患者，可減輕組織損傷，促進修復。用于：①化療患者：尤其是大劑量化療時；②放射治療患者；③各種低氧血癥：如急性貧血，成人呼吸窘迫綜合癥，敗血癥等；④肝臟疾病：包括病毒性、藥物毒性、酒精毒性及其它化學物質(zhì)毒性引起的肝臟損害。⑤亦可用于有機磷、胺基或硝基化合物中毒的輔助治療。20三.蛋白質(zhì)的一級結構(Primarystructure)

蛋白質(zhì)的一級結構由遺傳信息決定，其一級結構決定高級結構，一級結構是基本結構。但一級結構并不是決定蛋白質(zhì)空間構象的唯一因素。1.蛋白質(zhì)一級結構研究內(nèi)容

(1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目；

(2)多肽鏈的氨基酸順序；

(3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。★其中最重要的是多肽鏈氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎。212、蛋白質(zhì)一級結構測定的意義許多先天性疾病是由于某一重要的蛋白質(zhì)的一級結構發(fā)生了差錯引起的。如血紅蛋白β亞基6位Glu被Val代替（基因突變），即表現(xiàn)為鐮刀狀貧血，為世上最常見的血紅蛋白病。若β亞基6位Glu被Lys取代引起另一類貧血：血紅蛋白C病。比較不同生物細胞色素C的一級結構可以幫助了解物種間的進化關系，物種間越接近，則細胞色素C的一級結構越相似。3、蛋白質(zhì)一級結構測定策略

將大化小，逐段分析，對照兩套以上肽段分析結果，排出肽段前后位置，最后確定全順序。223.蛋白質(zhì)一級結構的測定

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來(Sanger由此1958年獲Nobel化學獎)，已有上千種蛋白質(zhì)的一級結構被測定。1965年我國科學家完成了結晶牛胰島素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白質(zhì)。（1）測定要求和準備樣品純度>97%以上；明確蛋白質(zhì)的分子量；明確蛋白質(zhì)的亞基組成；蛋白質(zhì)氨基酸組成和每種氨基酸的個數(shù)；測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。23(2)測定步驟

多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)須先進行拆分，可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)

幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起稱為寡聚蛋白質(zhì)，如血紅蛋白為四聚體、烯醇化酶為二聚體；測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目：通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目；二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的

-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。24

可通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈間的非共價力，應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。巰基的保護25二硫鍵的切割與保護過甲酸〔performicacid〕－CH2SO3H，不可逆

亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕可逆

－R1-S-S-R2＋SO3-→R1-S-+R2-S-SO3還原＋氧化不可逆

[β-巰基乙醇，DTT]

＋碘乙酸等→－S-CH2-COOHCys容易引起的問題Cys受空氣氧化而形成Cys-Cys，Cys和Cys-Cys會發(fā)生交換反應分析氨基酸組成時，Cys容易受修飾而不利于定量S-S鍵使蛋白酶難于作用Edman反應中不能形成穩(wěn)定的PTH-AA多條肽鏈以S-S鍵相連，擁有兩個以上N末端，難用Edman法測序26

分析多肽鏈的N-末端和C-末端:多肽鏈端基氨基酸分為N-端和C-端氨基酸兩類，最重要的是N-端氨基酸分析法;

多肽鏈斷裂成多個肽段：將多肽斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽的選擇性降解的方法有：酶解法-胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶；化學法-溴化氰水解法，能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。27測定每條多肽鏈氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序；確定原多肽鏈中二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置;測定每個肽段的氨基酸順序。28蛋白質(zhì)的分離純化Purification二硫鍵的拆分與保護S-Scleavage&blocking(亞基分離）Subunitseparation多種方法的部分水解Partialhydrolysis分離水解后得到的多肽Peptideseparation測序Sequencing重疊Overlapping總結：蛋白質(zhì)一級結構測定的步驟294、末端氨基酸測定方法

（1）二硝基氟苯（DNFB）法Sanger試劑(FDNB)標記N末端30（2）丹磺酰氯法

在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-aa。此法的優(yōu)點是丹磺酰-aa有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可達1

10-9mol。31(3)Edman降解法3233氨基酸的鑒定、分離純化PTH-AA34Edman降解與DNS-Cl法的結合35（4）肼解法

此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離;。（5）CNBr與羥胺法A-B-C-D-

CNBr，B=Met;羥胺法,B-C=Asn-Gly.

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（6）氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。

(7)內(nèi)肽酶法：酶種類底物合適的殘基水解部位A-B-C-D-

胰蛋白酶

Lys,Arg,C位不能是Pro

糜蛋白酶

Phe,Trp,Tyr或Leu、Met、HisC位不能是Pro

木瓜蛋白酶Lys,Leu或Arg,GlyC位不能是Pro

胰凝乳蛋白酶芳香族（Phe,Trp,Tyr）C位不能是Pro

胃蛋白酶芳香族（Phe,Trp,Tyr）37（8）羧肽酶法羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根基不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶C水解所有C-末端氨基酸殘基；羧肽酶Y水解所有C-末端氨基酸殘基；羧肽酶A能水解所有C-末端氨基酸殘基（Pro,Arg和Lys除外）；羧肽酶B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵；38例題2：一個五肽經(jīng)酸水解再經(jīng)堿水解，得到摩爾數(shù)相等的A、K、C、F、S等5種氨基酸混合物，用PITT進行N端分析，得到PTH-Ser；經(jīng)胰蛋白酶消化得到一種N端為半胱氨酸的三肽和一種N端為絲氨酸的二肽，繼續(xù)用糜蛋白酶消化上述三肽生成丙氨酸和另一個二肽，求這個五肽的氨基酸次序?！窘狻浚?）該五肽由等量的氨基酸組成，故含5種氨基酸，且N端是Ser；（2）胰蛋白酶水解部位為Lys、Arg，而水解得到N端為絲氨酸的二肽，該二肽另一氨基酸必為Lys；二肽為NH2-Ser-Lys-COOH；（3）胰蛋白酶水解得到N端為半胱氨酸的三肽，用糜蛋白酶消化該三肽生成丙氨酸和另一個二肽，該三肽為NH2-Cys-Phe-Ala-COOH；故該五肽為：NH3+-Ser-Lys-Cys-Phe-Ala-COO-或：NH2-Ser-Lys-Cys-Phe-Ala-COOH39四、蛋白質(zhì)的一級結構與功能

1、一級結構的局部斷裂

有些蛋白質(zhì)分子的部分肽鏈按特定方式斷裂后才能呈現(xiàn)生物活性.

血液凝固的機理致活因子作用凝血酶原，使其分子中的二個肽鍵斷裂。釋放出一個N端片段后成為有活性的凝血酶（p.187，圖4-21）；纖維蛋白原由2α條鏈、2β條鏈和2γ條鏈組成，在凝血酶作用下，從2條α鏈和2β條鏈的N端各斷裂一個-Arg-Gly-鍵，釋放出2個纖維肽A和2個纖維肽B，而剩下的纖維蛋白分子成為形成網(wǎng)狀結構的不溶性纖維蛋白（p.188，圖4-22，23）。40凝血酶致活物交聯(lián)的纖維蛋白（血凝塊）纖維蛋白溶解致活物

凝血酶原不溶性纖維蛋白纖維蛋白溶酶原

凝血酶（活性）纖維蛋白原纖維蛋白溶酶（活性）

纖維蛋白溶解412、胰島素原的激活

胰島素原可分中間的連接肽（C肽）、兩側的A鏈和B鏈三部分，C肽的一端通過兩個堿性氨基酸殘基（31、32位）與A鏈的C末端相連，另一端通過另兩個堿性氨基酸殘基（62、63位）與B鏈的N末端相連。

在高爾基體內(nèi)，特異的肽酶斷裂二個特定的肽鍵，釋放包括C肽的一段中間肽鏈后成為有活性的胰島素（A鏈和B鏈以二個二硫鍵相連著）。

A鏈31—32C肽62—63B鏈

SSSS423、鐮刀形細胞貧血癥血紅蛋白基因一個核苷酸的突變導致該蛋白分子中β-鏈第6位谷氨酸被纈氨酸替代；這個一級結構的細微差異導致患者血紅蛋白發(fā)生凝聚，變成鐮刀形，不能攜帶氧氣引起貧血，即血紅蛋白的功能喪失。43內(nèi)容提要術語解釋：肽、肽鍵、肽平面、蛋白質(zhì)一級結構，Edman降解。蛋白質(zhì)的氨基酸序列是通過肽鍵連接的，殘基的序列稱為蛋白質(zhì)的一級結構；一級結構可以通過Edman降解確定，大的多肽可用蛋白酶或化學試劑選擇性水解為小肽段，然后用Edman降解測序，比較幾套交叉重疊的氨基酸序列，可推測整個氨基酸序列。Edman降解：從多肽游離的N末端測定氨基酸殘基序列的過程。N末端測定氨基酸被異硫氰酸苯酯修飾，然后從肽鏈上切下修飾的殘基，再經(jīng)層析鑒定，余下的多肽鏈（少一個殘基）被回收進行下一輪降解。蛋白質(zhì)氨基酸序列與生物功能密切相關，某些位置氨基酸的改變會造成功能重大變化；同源蛋白中許多位置的氨基酸是相同的，而其它位置是不同的，氨基酸組成的差異表明親緣關系的差異。44習題1、下列試劑常用于蛋白質(zhì)研究：CNBr、異硫氰酸苯酯、丹磺酰氯、尿素、鹽酸、β-巰基乙醇、水合茚三酮、過甲酸、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。其中哪個最適合完成以下任務？（1）測定小肽的氨基酸序列；（2）鑒定肽的氨基酸末端殘基；（3）不含二硫鍵的蛋白質(zhì)可逆變性；（4）芳香族氨基酸殘基羧基側水解肽鍵（5）蛋氨酸殘基羧基側水解肽鍵（6）在賴氨酸和精氨酸殘基側水解肽鍵2、一蛋白蛋白酶水解得到R、L、D、Y、S等5種氨基酸，Edman降解，每次降解留下的肽段氨基酸組成如下：

(1)第一次Edman降解后，Arg,Asp,Leu,Ser(2)第二次Edman降解后，Arg,Asp,Ser(3)第三次Edman降解后，Arg,Ser(4)第四次Edman降解后，Ser

請排出這個五肽的氨基酸序列。453、根據(jù)下列信息求八肽的氨基酸序列

(1)酸水解得到Ala、Arg、Leu、Met、Phe、Thr、2Val；

(2)Sanger試劑處理，得到DNP-Ala；

(3)胰蛋白酶處理得到含Ala、Arg、Thr的三肽和含Leu、Met、Phe、2Val的四肽；再用Sanger試劑處理，分別得到DNP-Ala和DNP-Val；

(4)CNBr處理得到Ala、Arg、高絲氨酸內(nèi)酯、Thr、2Val和Leu、Phe兩個多肽,再用Sanger試劑處理，分別得到DNP-Ala和DNP-Leu.4、利用下面的信息確定多肽的序列：（1）利用1mol/L鹽酸在110℃完全水解后，氨基酸組成分析顯示含Gly、Leu、Phe、Tyr,摩爾比為2:1:1:1；（2）用2,4-二硝基氟苯處理，經(jīng)完全水解，水解產(chǎn)物經(jīng)色譜分析發(fā)現(xiàn)有酪氨酸的2,4-二硝基氟苯衍生物存在，沒有發(fā)現(xiàn)有游離的酪氨酸；（3）用胃蛋白酶完全水解，產(chǎn)物含有Leu、Phe的二肽和含2Gly、Tyr的三肽.46答案1、（1）異硫氰酸苯酯（2）丹磺酰氯（3）尿素（4）胰凝乳蛋白酶（5）CNBr（6）胰蛋白酶2、N-Tyr-Leu-Asp-Arg-Ser-C3、（1）該肽氨基酸組成為Ala、Arg、Leu、Met、Phe、Thr、2Val（2）N端為Ala（3）N-Ala-Thr-Arg-Val-C（4）該肽N端第六位為Met，第七位為Leu，第八位為Phe（5）綜合上述得第五位為Val

結論：N-Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe-C4、N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-C47Section2蛋白質(zhì)的三維結構蛋白質(zhì)三維結構的研究內(nèi)容多肽折疊的空間限制蛋白質(zhì)的二級結構超二級結構和結構域蛋白質(zhì)的三級結構蛋白質(zhì)的四級結構穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象的作用力48一、蛋白質(zhì)三維結構的研究內(nèi)容1、研究內(nèi)容主要研究蛋白質(zhì)分子中的原子或基團在三維空間的分布、排列及肽鏈主鏈在空間的走向。2、蛋白質(zhì)天然結構決定于三個因素

（1）蛋白質(zhì)的氨基酸序列（重要因素）（2）與溶劑分子相互作用（3）溶劑的pH與離子組成

493、蛋白質(zhì)的結構水平一級結構(primarystructure)：蛋白質(zhì)分子中的肽鍵、肽鏈、氨基酸序列和二硫鍵的位置；二級結構(secondarystructure):蛋白質(zhì)主鏈在空間的走向；三級結構(tertiarystructuer):由多個三維實體（結構域）構成的蛋白質(zhì)空間（近似球狀）構象；四級結構(quaternarystructure):寡聚蛋白的構象。超二級結構和結構域（二級結構和三級結構之間）（1）超二級結構(supersecondarystructure)：若干相鄰的二級結構單元相互作用，形成有規(guī)則的組合體。（2）結構域(structuredomain)：多肽鏈中相對獨立的三維實體。504、蛋白質(zhì)空間結構的研究方法旋光色散法重氫交換法紫外差示光譜法核磁共振光譜激光拉曼光譜X-晶體衍射質(zhì)子光譜色質(zhì)聯(lián)用圓二色性熒光偏振光譜X-射線衍射法51

20世紀30年代，Pauling和Corey就開始用X-射線衍射研究肽的結構。1、酰胺平面：參與肽鍵形成的兩個原子及相鄰的四個原子處于同一平面，形成了酰胺平面，也稱肽鍵平面，又稱一個肽單位；多肽鏈的主鏈由許多酰胺平面組成，平面之間以α碳原子相隔。二、多肽折疊的空間限制肽平面（酰胺平面）α碳原子α碳原子52肽鍵的鍵長介于C-N單鍵和雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能自由旋轉;(肽鍵中C-N鍵長0.132nm,C-N單鍵0.148nm,C=N鍵0.127nm）酰胺平面中的鍵長、鍵角是一定的；在酰胺平面中C=0與N-H呈反式，兩個α碳原子也呈反式；相鄰肽平面構成二面角。532、二面角二面角定義：在A、B、C、D四原子連接的系統(tǒng)中，含A、B、C的平面與含B、C、D的平面之間的夾角。肽單位內(nèi)，Cα-C鍵和Cα-N鍵是單鍵，可以自由旋轉，其中繞Cα-C鍵旋轉的角度(N-Cα-C-N)稱為ψ，繞Cα-N鍵旋轉的角度(C-N-Cα-C)稱為φ。二面角取決于R基團的空間位阻效應。二面角（ψ，φ）可以在0-±180°范圍內(nèi)變動,順時針為正,反之為負。當φ=180°、ψ=180°時,鏈兩個相鄰肽單位，呈充分伸展；而φ=0°、ψ=0°，將發(fā)生空間重疊,實際上不存在。ψ和φ這一對二面角決定了相鄰兩個酰胺平面的相對位置，也就決定了肽鏈的構象。54Linus

CarlPauling（1901-1994）1901年2月28日生于美國俄勒岡州波特蘭1922年

畢業(yè)于俄勒岡州立大學化學工程系1925年獲加州理工學院博士學位1922～1963年在加州理工學院任教，1931年任化學教授。1926年，留學Sommerfeld實驗室（1年7個月）1928年，發(fā)明雜化軌道，創(chuàng)立量子化學1930年，去LaurenceBragg實驗室學X-ray衍射1936年，與Mirsky一起發(fā)表蛋白質(zhì)變性的理論氫鍵1937年，開始搭構α-helix模型，發(fā)現(xiàn)螺距5.4A的周期，與Astbury的Keratin蛋白測定得到的5.1A不符；此后化了約10年的時間得出肽鍵的6個原子在同一平面上的結論1949年，人造絲X-ray數(shù)據(jù)發(fā)表，他看到了5.4A的周期1950年，α-helix模型發(fā)表，次年發(fā)表β-sheet模型1954年，Nobel化學獎，1963年，Nobel和平獎1967～1969年任加利福尼亞大學化學教授1969～1974年任斯坦福大學化學教授，1974年任榮譽教授。55三、蛋白質(zhì)的二級結構1、二級結構定義

肽鏈主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉及折疊，只涉及肽鏈主鏈的構象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵，主要有

-螺旋、-折疊、-轉角，不同蛋白質(zhì)二級結構是不同的。2.-螺旋（1）α-螺旋的結構要點

-螺旋中肽平面的鍵長和鍵角一定,肽鍵的原子排列呈反式構型,相鄰的肽平面構成兩面角。56肽平面的相疊形成α螺旋57肽鏈像螺旋一樣盤曲上升，每3.6個氨基酸殘基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度為0.54nm，每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，螺旋上升時，每個殘基沿軸旋轉100o；α-螺旋穩(wěn)定性主要靠氫鍵來維持，多肽主鏈上第n個殘基的羰基和第n+4個殘基的酰氨基形成氫鍵，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13，氫鍵的取向幾乎與軸平行；α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白質(zhì)絕大部分是右手螺旋，到目前為止僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了一段左手螺旋；

58左手和右手螺旋59總結--α螺旋特性氫鍵取向與主軸基本平行右旋，3.6個氨基酸一個周期，螺距0.54nm第n個AA(NH)與第n+4個AA(CO)形成氫鍵，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13。60例題1：一個α-螺旋片段含180個氨基酸殘基，該片段有多少圈螺旋？計算α-螺旋片段的軸長?！窘狻?/p>

α-螺旋每一圈含氨基酸3.6個，螺距為0.54nm,

螺旋圈數(shù)=180個/3.6=50,

α-螺旋片段的軸長=50×0.54=27nm61（2）側鏈基團對α-螺旋的影響多肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，α-螺旋就不穩(wěn)定。如出現(xiàn)pro，α-螺旋就被中斷，產(chǎn)生一個彎（bend）或結節(jié)（kink）（不能形成氫鍵，側鏈占據(jù)相鄰殘基空間），Pro常出現(xiàn)在α-螺旋末端；62空間位阻：Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者；而Asn、Leu側鏈很大，防礙α螺旋的形成；若肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側鏈的氨基酸如Ile，也難以形成α-螺旋。靜電斥力：若一段肽鏈有多個Glu或Asp相鄰，則因pH=7.0時都帶負電荷，防礙α螺旋的形成；同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi)，正電荷相斥，也防礙α螺旋的形成。63（4）螺旋的寫法除了上面這種典型的α-螺旋外，還有一些不典型的α-螺旋，所以規(guī)定了有關螺旋的寫法，用“nS”來表示。n為螺旋上升一圈氨基酸的殘基數(shù)；S為氫鍵封閉環(huán)內(nèi)的原子數(shù)；典型的α-螺旋用3.613表示，非典型的α-螺旋有3.010、4.416（π螺旋）等。（3）α-螺旋在不同蛋白質(zhì)中的情況α-角蛋白：全部由α-螺旋構成；肌紅蛋白：大部分由α-螺旋構成；溶菌酶：僅含一部分α-螺旋；鐵氧還蛋白：完全不具有α-螺旋。643.010helixπ16

helixαhelixPauling預測的三種螺旋結構65

左手螺旋-膠原蛋白：是脊椎動物中含量最豐富的蛋白質(zhì)。膠原蛋白中缺乏Cys和Thr，含有Gly-X-Y的重復結構。66膠原蛋白Collagen的特殊性膠原蛋白在細胞外基質(zhì)中聚集為超分子結構，分子量為300kD。膠原蛋白由3條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型（因為富含Gly、Pro及其修飾氨基酸）。3條左手螺旋鏈叉相互纏繞成右手螺旋結構，即超螺旋結構閉膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，分子結構非常穩(wěn)定，具有低免疫原性和良好的生物相容性。Collagen是一種生物高分子物質(zhì)，在動物細胞中扮演結合組織的角色。67結締組織中的膠原蛋白68

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構象。①

-折疊中，

-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直。②

-折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈間形成的，也可以在同一肽鏈的不同部分間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。3.

-折疊69③

-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊，相鄰R基團之間的距離為0.65nm。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反，相鄰R基團之間的距離為0.7nm70平行β折疊71反平行β折疊72

4.

-轉角——半圈3.010螺旋

-轉角主要存在于球狀蛋白分子中，由四個氨基酸殘基組成，四個形成轉角的殘基中，第三個一般為甘氨酸，殘基彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結構。735、角蛋白(keratin)毛發(fā)、羽毛、角、蹄等纖維蛋白，有α-角蛋白和β-角蛋白兩類,哺乳動物角蛋白為α-角蛋白、鳥類及爬行類為β-角蛋白。

頭發(fā)和羊毛的基本結構是α-角蛋白，α-螺旋是α-角蛋白的基本結構單位;α-角蛋白（如龜殼）富含α-螺旋，也富含胱氨酸殘基，后者提供相鄰多肽鏈間的二硫（—S—S—）橋，這種橋是共價鍵，因而非常牢固，可使α-螺旋連在一起構成凝聚強度很高的纖維,很難溶解，也經(jīng)受得起一定的拉力。蠶絲蛋白是β折疊,富含Gly、Ala、Ser,牢固但不能拉伸。74α-角蛋白

毛料衣服易蛀,由于一類蛾的幼蟲消化液中有大量巰基化合物，使二硫鍵還原成巰基，肽鏈之間的聚合被解除，肽鏈被消化。75燙發(fā)的科學原理經(jīng)電鏡和α-射線衍射結構分析，頭發(fā)為α-角蛋白，含3條有α-螺旋結構的多肽鏈互相纏繞形成類似繩索的原纖維，11股原纖維結合成微纖維，進而形成粗纖維，構成頭發(fā)結構的基本元件。

在濕熱的條件下α-螺旋可以伸長成β-折疊結構，冷卻后又恢復原狀。如在彎曲的頭發(fā)中，加還原劑溶液使二硫鍵還原成半胱氨酸的巰基并加熱破壞α-螺旋的氫鍵，可使頭發(fā)伸直。

假若過一段時間后除去還原劑而施以氧化劑，就可造成新的二硫鍵。經(jīng)過洗發(fā)和冷卻后，頭發(fā)又形成α-螺旋并變成所要的彎曲發(fā)型，因為新的二硫鍵與原來的位置不同。

76β-角蛋白-絲心蛋白77例題2：羊毛衫等羊毛制品在熱水中洗滌變長，經(jīng)干燥又收縮，而絲制品經(jīng)同樣處理不收縮，請解釋這兩種現(xiàn)象?！窘狻垦蛎w維多肽鏈的主要構件單位為連續(xù)α-螺旋圈，螺距為0.54nm，在加熱下纖維多肽伸展為

-折疊，相鄰R基團之間的距離變?yōu)?.7nm，所以變長了；干燥后重新由-折疊轉化為α-螺旋，所以收縮了。絲制品是絲心蛋白，為

-折疊的多肽鏈，其內(nèi)含絲氨酸等包裝緊密的側鏈，比羊毛纖維多肽中的α-螺旋穩(wěn)定，所以洗滌干燥構象基本不變。78四、超二級結構和結構域１、超二級結構蛋白質(zhì)分子中若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、空間上能辨認的二級結構組合，充當三級結構的組件；超二級結構主要有αα、ββ、βαβ、βββ等幾種類型．超二級結構在結構層次上高于二級結構，但沒有聚集成具有功能的結構域．792、超二級結構基本組合方式（1）αα：有兩股或三股右手-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋，重復距離約140?。螺旋鏈之間是由向著超螺旋內(nèi)部的非極性側鏈相互作用，而極性側鏈處于蛋白質(zhì)分子表面，與水接觸。超螺旋的穩(wěn)定性主要是非極性側鏈間的范德華相互作用的結果。（2）βαβ：最簡單的βαβ組合是由二段平行式的β-鏈和一段連接鏈組成。連接鏈是α-螺旋或無規(guī)則卷曲，大體上反平行于β-鏈。最常見的βαβ組合是由三段平行式的β-鏈和二段α-螺旋鏈構成。連接鏈都是以右手交叉連接方式處于β-折疊片的一側。（3）ββ：有β-曲折和回形拓撲結構二種組合形式。

β-曲折是由一級結構上連續(xù)、在β-折疊中相鄰的三條反平行式β-鏈通過緊湊的β-轉角連接而成。回形拓撲結構也是反平行式β-折疊片通過緊湊的β-轉角連接形成，但構成回形結構。8081828384853、結構域（domain）對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結構，具有特殊的功能，多為蛋白質(zhì)的活性部位，這種相對獨立的三維實體稱結構域。（1）結構域的特征

結構域通常是幾個超二級結構的組合，對于較小的蛋白質(zhì)分子，結構域與三級結構等同，即這些蛋白為單結構域；結構域一般由100-200個氨基酸殘基組成，但大小可達40-400個殘基；氨基酸可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的；結構域之間常形成裂隙，比較松散，往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位；酶的活性中心往往位于兩個結構域的界面上。86聚酮合酶（polyketidesynthase,PKS）結構域87結構域之間由“鉸鏈區(qū)”相連，使分子構象有一定的柔性，通過結構域之間的相對運動，使蛋白質(zhì)分子實現(xiàn)一定的生物功能；蛋白質(zhì)分子內(nèi)，結構域可作為結構單位進行相對獨立的運動，水解出來后仍能維持穩(wěn)定的結構，甚至保留某些生物活性；有時一個結構域就是蛋白質(zhì)，通常一個蛋白質(zhì)包含多個結構域，如纖連蛋白含有6個結構域。

（2）常見的結構域

鋅指結構，Zincfinger；亮氨酸拉鏈結構，Leucinzipper；EF手型鈣結合性模序(EF-handCa2+-bindingmotif）。88肌鈣蛋白的兩個不同的鈣結合域89模序（motif）：蛋白質(zhì)分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個有特殊功能的空間結構。如鈣結合蛋白中的結合鈣離子的模序，即EF手型鈣結合性模序(EF-handCa2+-bindingmotif）。α螺旋α螺旋NCCa2+鈣結合蛋白中結合鈣離子的模序90五、蛋白質(zhì)的三級結構1、定義：蛋白質(zhì)的三級結構是指多肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即整條肽鏈的三維構象。蛋白質(zhì)的三級結構是在多種二級結構的基礎上進一步盤旋、折疊，從而生成特定的空間結構（球狀），包括主鏈和側鏈的所有原子的空間排布，一般非極性側鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核，極性側鏈在分子表面。2、三級結構的主要作用力：為側鏈間的相互作用:包括氫鍵、離子鍵、疏水鍵及二硫鍵。3、纖維蛋白與球蛋白的空間結構纖維蛋白一般不溶于水，有一定強度，具有簡單的二級結構元件，在生物體內(nèi)起結構構件作用。球蛋白具復雜的三級結構，一條多肽鏈中含幾種類型的二級結構，組成兩個以上相對獨立的三維結構實體（結構域）。其親水-R基位于球狀表面，疏水-R基位于球狀內(nèi)部，因此球蛋白溶于水。914、典型球蛋白-肌紅蛋白

肌紅蛋白是哺乳動物肌肉中儲存O2的蛋白質(zhì)，由153個氨基酸組成的單鏈蛋白，分子量17.8KD（人）、16.7KD（鯨）。（1）球型結構4×3.5×2.5nm；（2）肽鏈的75%構成α-螺旋，具8個α-螺區(qū)；（3）Pro、Ile、Ser、Thr、Asn都出現(xiàn)在拐彎處；（4）分子疏水基都聚集在內(nèi)部，整個分子致密結實，分子內(nèi)部只有一個適于包含4個水分子的空間；（5）具有一個血紅素輔基，垂直伸出表面，卟啉Fe有6個配位鍵，其中4個與卟啉環(huán)上的N原子相連，1個與蛋白肽鏈中的His咪唑基相連，另1個用于結合氧氣。92細胞色素C溶菌酶核糖核酸酶幾種小分子蛋白的三級結構93六、蛋白質(zhì)的四級結構1、四級結構：蛋白質(zhì)的四級結構是指亞基的種類、數(shù)量以及各個亞基在寡聚蛋白質(zhì)中的空間排布和亞基間的相互作用。2、亞基（subunit）：寡聚蛋白中每個獨立三級結構單元稱為亞基。3、寡聚蛋白：許多蛋白質(zhì)是由兩個或兩個以上獨立的三級結構通過非共價鍵結合成的多聚體，稱為寡聚蛋白，也稱單體蛋白質(zhì)。寡聚蛋白分為均一寡聚蛋白（相同亞基構成）和非均一寡聚蛋白（由不同亞級構成）。4、維持四級結構穩(wěn)定的作用力：二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水鍵。含有四級結構的蛋白質(zhì)，單獨的亞基一般沒有生物學功能，只有完整的四級結構才有生物學功能。9495965、分子伴侶（chaperon）

蛋白質(zhì)空間構象的正確形成除一級結構為決定因素外，還需要一類稱為分子伴侶或稱伴娘蛋白（chaperon）的蛋白質(zhì)參加。分子伴侶可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確的折疊；也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。分子伴侶對二硫鍵的形成起重要作用。97七．穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象的作用力

一級結構→二級結構→超二級結構→結構域→三級結構→亞基→四級結構98（1）氫鍵電負性原子（N、O、F）與氫形成的基團（N-H、O-H）具有很大的偶極距，成鍵電子云分布偏向負電性大的重原子核，而氫原子核周圍的電子分布就少，正電荷的氫核就在外側裸露，所以遇到另一個電負性強的原子時，就產(chǎn)生靜電吸引，即所謂氫鍵。

X─HYX、Y是負電性強的原子，X─H是共價鍵，HY是氫鍵，X是氫（質(zhì)子）供體，Y是氫（質(zhì)子）受體。氫鍵特性：方向性和飽和性。多肽主鏈上的羰基氧和酰氨氫之間形成的氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級結構的主要作用力。此外，在側鏈與側鏈、側鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側鏈或主鏈肽基與水之間形成氫鍵，參與三級結構。1．各種作用力概念

99（2）疏水相互作用力

水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)總是傾向把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，稱疏水相互作用（疏水效應）。

疏水相互作用是疏水基團或疏水側鏈出自避開水的需要而被迫接近。100（3）離子鍵

離子鍵是正電荷與負電荷之間的一種靜電相互作用。在生理pH下，酸性氨基酸（Asp、Glu）的側鏈可解離成負離子，堿性氨基酸（Lys、Arg、His）的側鏈可解離成正離子。大多數(shù)情況下，這些基團分布在球狀蛋白分子表面，與介質(zhì)水分子發(fā)生電荷-偶極之間的相互作用形成排列有序的水化層，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象有一定作用(負電荷H+-OH，正電荷HO--H+)。

結合蛋白中若輔基是金屬離子，也存在絡合形式的配外鍵101（4）共價鍵

二硫鍵是肽鏈內(nèi)部或肽鏈間的半胱氨酸的巰基之間形成的共價鍵，它對穩(wěn)定構象起作用。大多數(shù)二硫鍵在β-轉角附近形成。結合蛋白中若輔基是金屬離子，也存在以絡合形式的配外鍵。102（5）范德華力廣義的范德華力包括三種較弱的作用力：定向效應：發(fā)生在極性分子或基團之間，是永久偶極間的靜電相互作用，氫鍵可以認為屬于這種范德華力。(-OHHO-)

誘導效應：發(fā)生在極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)之間，是永久偶極與由它誘導而來的誘導偶極之間的相互作用。(-OHCH3-)

分散效應：為主要的范德華力，是非極性分子或基團間的相互作用。這是瞬時偶極，即偶極方向瞬時變化，是由其所在的分子或基團中電子電荷密度的波動所造成的。

(-CH3CH3-)

范德華力包括吸引力和斥力兩種相互作用。因此，范德華力（吸引力）只有當兩個非鍵原子處于一定距離時才達到最大，這稱范德華距離（=兩個原子的范德華半徑之和）。

1032、穩(wěn)定蛋白質(zhì)各級結構的作用力維系蛋白質(zhì)分子的一級結構：肽鍵；維系蛋白質(zhì)分子的二級結構：氫鍵；維系蛋白質(zhì)分子的三級結構：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵；維系蛋白質(zhì)分子的四級結構：二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水相互作用力。a離子鍵b氫鍵c疏水相互作用力

d范德華力e二硫鍵f肽鍵1043、各種作用力的特點氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵；氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大；疏水相互作用力對維持三級結構特別重要；鹽鍵數(shù)量?。欢蜴I對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構象越穩(wěn)定。離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力105內(nèi)容提要1、術語解釋：蛋白質(zhì)的一級結構、蛋白質(zhì)的二級結構、蛋白質(zhì)的三級結構、蛋白質(zhì)的四級結構，超二級結構、結構域、模序；2、術語解釋：α-螺旋、

-折疊、

-轉角，氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵；3、寡聚蛋白、亞基，別構蛋白、別構效應，伴侶蛋白；4、維持蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的二級結構、蛋白質(zhì)的三級結構、蛋白質(zhì)的四級結構的作用力。5、α螺旋為右手螺旋，3.6個氨基酸一個周期，螺距0.54nm；第n個AA(NH)與第n-4個AA(CO)形成氫鍵，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13；氫鍵取向與主軸基本平行。6、纖維蛋白與球蛋白、角蛋白與膠原蛋白、血紅蛋白與肌紅蛋白的結構特征與功能。1061、舉例說明蛋白質(zhì)一級結構決定空間結構。2、人發(fā)每年以18cm左右的速度生長，頭發(fā)是以α-螺旋為基本結構單元的α-蛋白，若α-螺旋的合成是頭發(fā)生長的限速因素，計算肽鍵的合成速度。3、合成的多肽多聚谷氨酸，在pH=3的溶液里形成α-螺旋，而在pH=5以上溶液成為伸展狀態(tài)，試解釋該現(xiàn)象？在哪種pH下，多聚賴氨酸也會形成α-螺旋？4、蛋白質(zhì)的一級結構可以預測其空間結構，假設下列27肽：NH3+-Ile-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Glu-Ala-Met-Cys-Lys-Try-Glu-Ala-Gln-Pro-Asp-Gly-Met-Glu-Cys-Ala-Phe-His-Arg-COO-（1）請將多肽編號，指明何處可能形成鏈內(nèi)二硫鍵？（2）預測哪一部位會出現(xiàn)

-轉角？（3）若該多肽只是一個球蛋白的亞基，D、L、S、V、E、K這六種氨基酸哪些可能分布在球蛋白的外表面和內(nèi)表面？習題107答案2、考慮α-螺旋每一圈3.6個氨基酸殘基螺距0.54nm,每秒鐘大約合成38個肽鍵。3、離子化側鏈的氨基酸殘基構成的α-螺旋對溶液pH比較敏感。多聚谷氨酸在pH=3的溶液里γ-COOH（pK=4.25）未發(fā)生解離，不帶電荷,谷氨酸之間沒有產(chǎn)生排斥,所以形成α-螺旋;而在pH=5的溶液里γ-COOH發(fā)生解離,帶電荷,谷氨酸之間產(chǎn)生排斥,成為伸展狀態(tài)。

Lys側鏈NH3的pK=10.5,當溶液的pH高于10.5時，側鏈不解離不帶電荷，可形成α-螺旋；若在降低的pH溶液里側鏈NH3發(fā)生解離,帶電荷,產(chǎn)生排斥,成為伸展狀態(tài)。4、（1）可能在7位和18位打彎，因為呈現(xiàn)順式構形的Pro更容易出現(xiàn)在轉彎處。（2）12位和23位的半胱氨基酸可形成二硫鍵（3）分布在球蛋白外表面的基團為Asp、Gln、Lys，分布在內(nèi)部的為Leu、Val,Thr極性疏水性兩者兼而有之，可出現(xiàn)在外表面，也可在內(nèi)部.108提綱蛋白質(zhì)一級結構與功能的關系肌紅蛋白質(zhì)的構象與功能血紅蛋白的構象與功能蛋白結構與功能進化Section3蛋白質(zhì)結構與功能關系109為什么研究蛋白質(zhì)的結構與功能？對蛋白質(zhì)結構和作用機理的深層次理解對蛋白質(zhì)結構進行改造的基礎對蛋白質(zhì)功能的控制人工合成具有新功能的蛋白質(zhì)110一、一級結構是蛋白質(zhì)空間結構與功能的基礎1、蛋白質(zhì)的組成影響蛋白質(zhì)功能（1）Ser的改變最不易改變蛋白功能：Ser有極性、不帶電荷、側鏈中等大小，一般說來被其它極性殘基（帶電荷或不帶電荷）取代后，氫鍵不破壞，蛋白質(zhì)的空間結構不會產(chǎn)生很大的改變。（2）Trp的改變最容易改變蛋白質(zhì)的功能：Trp是一個芳香族大側鏈殘基，常出現(xiàn)在在球型非級性內(nèi)部，它不能被其它小側鏈殘基取代；由于苯環(huán)比吲哚環(huán)形成的范德華力少，也不能被Phe取代。（3）Lys變成Arg、Leu變成Ile的替換一般對蛋白質(zhì)的功能無影響：Lys和Arg都是帶正電的大小相當?shù)膫孺?，Leu和Ile均是大小相當?shù)聂人畟孺湥虼讼嗷ト〈静挥绊懙鞍卓臻g結構。（4）當?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生點突變Gly一般在鏈中位置最好不變：Gly是一最小側鏈的殘基，在空間構象上具有靈活性，常出現(xiàn)在轉角結構中，任何其它殘基對它的取代均引起蛋白空間結構的巨大變化。當然，當Gly殘基不受構象限制時，可以通過點突變被其它殘基取代。1112、蛋白質(zhì)的一級結構決定高級結構例1：核糖核酸酶復性實驗在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理，4個二硫鍵斷裂，整個肽鏈松散無規(guī)則，酶活性散失。用透析法除去尿素和巰基乙醇，此酶又恢復活性達原來95%以上，復性后酶的理化性質(zhì)與原來也一樣。在105中組合中，只選擇了其中的一種（天然構象）。此實驗證明：蛋白質(zhì)的一級結構決定它的高級結構，即一維信息決定三維構象。112Anfinsen的核糖核酸酶復性實驗SHSH5826_40SHSHSH657284SH95SH110SH58658426954011072天然狀態(tài)β-巰基乙醇尿素天然狀態(tài)無活性268495401105865721133、一級結構的局部變化與蛋白質(zhì)的激活

如果蛋白質(zhì)的氨基酸順序發(fā)生改變，通常其功能也會發(fā)生改變－蛋白質(zhì)前體的激活.

體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時，常帶有抑制肽（如信號肽），呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原。蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?。?、胰島素胰島素剛合成時是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原。114115

前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱信號肽；信號肽被切去，剩下的是胰島素原（86個氨基酸組成的肽鏈）胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當C肽被切除后才成為有51個殘基，分A（21個AA）、B(30個AA)兩條鏈的胰島素分子單體。116胰島素的生理意義胰島素是一種蛋白類激素，由胰島β細胞合成和分泌。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血;在病理情況下，胰島β細胞釋放胰島素原增多，血中胰島素原水平升高,造成糖尿病.1型糖尿病由于胰島細胞損壞，胰島素合成和分泌極度下降，剛合成的胰島素原未轉變?yōu)橐葝u素即釋放入血，體內(nèi)胰島素絕對缺乏，造成血漿胰島素原升高。2型糖尿病體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，胰島素甚至產(chǎn)生過多，但胰島素的作用效果卻大打折扣，產(chǎn)生“胰島素抵抗”（β細胞膜葡萄糖受體出現(xiàn)異常、胰島素不能與其受體結合而引起周圍胰島素抵抗、腎上腺素分泌增加使胰島素釋放抑制），胰島素相對缺乏，可口服藥物刺激體內(nèi)胰島素的分泌達到治療。胰島β細胞瘤、家族性高胰島素血癥患者血漿胰島素原水平明顯升高；慢性腎功能不全時，胰島素原的分解代謝降低，可致血漿胰島素原升高;甲亢時亦可出現(xiàn)血漿胰島素原水平升高。117例3：凝乳蛋白酶和胰蛋白酶凝乳蛋白酶原（無活性）胃蛋白酶凝乳蛋白酶胰蛋白酶原（無活性）118例4：彈性蛋白（Elastin）

主要分布于動物體內(nèi)富有彈性的組織（如肺、大動脈等）中，初合成時為水溶性單體稱為原彈性蛋白。原彈性蛋白從細胞分泌出來后，Lys的εNH2受賴氨酰氧化酶催化而氧化脫氨生成醛基。3個Lys衍生的醛基與1個Lys的εNH2縮合形成十字架樣的特殊交聯(lián)，使彈性蛋白卷曲而具有彈性。交聯(lián)后極穩(wěn)定，極難溶解。1191、肌紅蛋白三維結構肌紅蛋白(myoglobin)是哺乳動物細胞主要是肌細胞貯存和分配氧的蛋白質(zhì)，由一條153aa的多肽鏈和一個血紅素輔基組成。除去血紅素的脫輔基肌紅蛋白稱珠蛋白。分子量17.8KD（人）、16.7KD（鯨）。二.肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）的構象與功能120

肌紅蛋白由8段直的α螺旋組成，命名為A、B、C……H，80%的氨基酸都處于α螺旋中。8個α螺旋大體上組成2層，α螺旋的拐彎處由1-8個aa組成的無規(guī)卷曲，C末端也有一段5個aa的松散肽鏈；肌紅蛋白的4個Pro各自處于一個拐彎處；球型結構4×3.5×2.5nm，肽鏈的75%構成α-螺旋，具8個α-螺區(qū)；Pro、Ile、Ser、Thr、Asn都出現(xiàn)在拐彎處。親水氨基酸在分子表面，疏水氨基酸在分子內(nèi)部，是可溶性蛋白。分子疏水基都聚集在內(nèi)部，整個分子致密結實，分子內(nèi)部只有一個適于包含4個水分子的空間。

Mb分子內(nèi)部有一個口袋形空穴，血紅素輔基居于其中垂直伸出表面；血紅素是血紅蛋白及細胞色素等的輔基，具有重要的生理功能。121

五十年代，JohnKendrew用X衍射對抹香鯨肌紅蛋白的三級結構研究獲得成功，第一個獲得完整構象的蛋白質(zhì)。1962年Kendrew和Perutz由于測定了肌紅蛋白及血紅蛋白的高級結構而獲Nobel化學獎。1222、血紅素血紅素是含鐵的卟啉化合物，卟啉由四個吡咯環(huán)組成，鐵原子位于卟啉環(huán)的中央。Fe2+有6個配位鍵，其中4個和吡咯環(huán)的N配位結合，1個與Mb93位（F8）His結合，另1個結合氧氣（氧與Fe2+形成第6個配位鍵，接近64位E7His）。1233.O2與肌紅蛋白的結合

作為輔基的血紅素非共價結合于肌紅蛋白分子的疏水空穴中肌紅蛋白中血紅素的第5位配位鍵與F8位上的His殘基的咪唑N結合，當肌紅蛋白結合氧成氧合血紅蛋白時，第6位配位鍵與氧分子結合。游離鐵卟啉結合CO比結合O2強25000倍，由于空間位阻效應，在肌紅蛋白中血紅素與CO的親和力僅比O2大約250倍。因為CO的直線結合受到E7組氨酸的空間位阻。這種作用可以防止生物代謝過程中產(chǎn)生的CO與O2競爭結合肌紅蛋白和血紅蛋白。肌紅蛋白及血紅蛋白多肽微環(huán)境的作用：固定血紅素；保護血紅素免受氧化；為O2分子提供一個適合的結合部位。124三、血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)的構象與功能

1、血紅蛋白（1）四級結構（測定由佩魯茨1958年完成）Hb為球狀寡聚蛋白，由α2β2四個亞基(珠蛋白)和血紅素組成，每個亞基都有一個血紅素基和一個氧結合部位，分子量65000，α鏈141個殘基，β鏈146個殘基。親水性側鏈基團在分子表面，疏水性基團在分子內(nèi)部。125成人紅細胞中主要為HbA1(α2β2)，α鏈141aa、β鏈146aa，各帶一個血紅素與O2結合，所以一分子Hb能與4分子O2結合。不同發(fā)育階段α鏈相同,β鏈不同，胎兒期為αγ，胚胎期為αε1262、別構效應（1）別構效應（allostericeffect）通過蛋白質(zhì)與配基結合改變蛋白質(zhì)構象，進而改變其生物活性，稱為別構效應。具有別構效應的蛋白叫別構蛋白，配基稱為別構劑；別構蛋白就是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，別構蛋白都是寡聚蛋白。別構蛋白的亞基都有活性部位（或別構部位與調(diào)節(jié)部位），這樣別構蛋白質(zhì)分子中至少含有二個活性部位，各部位之間可通過構象變化傳遞發(fā)生的過程，構象變化可以從一個原體傳遞給另一個原體，引起協(xié)同的相互作用。

（2）同位效應：相互作用的都是活性部位，即一個亞基與配基的結合會影響另一個亞基與配基的結合。如果這種影響是促進作用，則是正協(xié)同效應；如果這種影響是降低作用，則是負協(xié)同效應。

（3）異位效應：別構部位與活性部位之間的相互影響。127氧分數(shù)飽和度方程：Y=P(O2)/（P(O2)+K）的氧飽和曲線為為直角雙曲線3、Mb與Hb的氧飽和曲線

(1)Mb的氧飽和曲線為為直角雙曲線

Mb與O2結合的直角雙曲線提示單個血紅素與1個O2結合的一個恒定平衡常數(shù)128

Mb的P50=0.13KPa(1mmHg)

說明Mb對氧有很強的親和力。在體內(nèi)毛細血管中氧分壓大于4KPa(30mmHg)，組織中Mb幾乎全與O2結合而達到飽和，只有細胞內(nèi)氧耗很大而使PO2下降到很低時，Mb才釋放其中的氧，故組織中的肌紅蛋白是很好的儲氧物質(zhì)。129（2）Hb的氧飽和曲線Hb的4個亞基與4個O2結合時，每一步的平衡常數(shù)是不同的

K1＜K2=K3＜K4K=[Hb][O2]/[Hb(O2)4]氧分數(shù)飽和度方程：Y=P4(O2)/（P4(O2)+K）氧飽和曲線為S形130(2)氧合血紅蛋白和去氧合血紅蛋白代表不同的構象血紅蛋白在與氧結合的過程中構像發(fā)生改變一個亞基與氧結合后，引起該亞基構象改變;進而引起另三個亞基的構象改變;整個分子構象改變，從而與氧的結合能力增加131Perutz等利用X線衍射分析了Hb和氧合Hb的三維結構圖譜，解釋了正協(xié)同效應。未結合O2時，Hb結構緊密，稱為緊張態(tài)（T態(tài)），T態(tài)Hb與O2親和力小；結合O2

后，結構變得相對松弛，稱為松弛態(tài)（R態(tài)）。R態(tài)與O2的親和力明顯高于T態(tài)，因此T態(tài)是去氧血紅蛋白的構象態(tài)。T態(tài)的去氧血紅蛋白有專一的氫鍵和鹽橋起著穩(wěn)定作用。4個亞基的C末端處于束縛狀態(tài)，例如β1鏈中C末端的HC3位His+與FG1位的Asp-形成離子鍵、而羧基則與α2亞基中C5位Lys形成離子鍵。Question:多少個鏈間鹽橋？132133(3)血紅蛋白的協(xié)同性氧結合血紅蛋白與氧的結合具有正協(xié)同性同促效應，即一個O2的結合能夠增加同一個血紅蛋白分子中其余空余氧結合部位對O2的親和力。這里O2即是正常的配體，也是正同促調(diào)節(jié)物。血紅蛋白與氧的結合還受其他分子，例如質(zhì)子、二氧化碳、2,3-二磷酸甘油酸(BPG)的調(diào)劑。雖然它們在血紅蛋白分子上的結合部位離血紅素很遠，但它們同樣可以極大地影響血紅蛋白的氧結合性質(zhì)。例如Bohr效應和BPG效應，這種在空間上相隔遠的部位之間的相互作用成為別構效應。1344、血紅蛋白(Hb)與肌紅蛋白的比較Hb由四個亞基組成，而肌紅蛋白是一條多肽鏈；與肌紅蛋白相比，血紅蛋白的α鏈有一個縮短的H螺旋，并缺失一個D螺旋，β鏈也有一個縮短的H螺旋。雖然肌紅蛋白、血紅蛋白的α鏈、β鏈在141個aa殘基中只有27個位置是共有的，但是這3者的三級結構非常相似。

Hb氧飽和曲線為S形，Mb為直角雙曲線血紅素肌紅蛋白血紅蛋白β亞基1355、Bohr效應

1904年ChristianBohr發(fā)現(xiàn)Hb與O2的結合也受CO2及pH影響。PCO2升高時，Hb與O2的結合降低，酸性溶液中Hb與O2的親合力也降低，氧解離曲線右移。定義：CO2濃度的增加降低細胞內(nèi)的pH，血紅蛋白結合H+和CO2將導致血紅蛋白與氧的親和力下降，利于血紅蛋白在外周細胞釋放O2，這種現(xiàn)象稱為Bohr效應。PCO2升高實際上是pH下降影響Hb。pH降低，即溶液中H+濃度升高，使-NH2及咪唑基等質(zhì)子化，有利于分子內(nèi)部鹽鍵的形成，使Hb結構趨向緊密，從而降低Hb與O2親和力，Mb沒有四級結構也就沒有Bohr效應。136Bohr效應使Hb運輸O2效率更為提高。肺部呼出CO2，PCO2下降，Hb與O2親和力加強，利于結合更多氧輸入體內(nèi)。當血液流經(jīng)組織時，CO2自組織進入血液，PCO2升高，pH下降，Hb與O2親和力減弱，有利于O2釋放入組織。1372,3-二磷酸甘油（BPG）6、BPG降低Hb對O2的親和力血紅蛋白只有一個BPG結合部位。BP