微生物檢驗(yàn)理論課 05微生物學(xué)檢驗(yàn)自動(dòng)化 學(xué)習(xí)資料

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)自動(dòng)化和微型化南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院芮勇宇我們現(xiàn)主要使用BDPhoenix100儀器，可同時(shí)檢測(cè)100個(gè)樣本。下面以該儀器為例，對(duì)全自動(dòng)微生物檢測(cè)儀器的鑒定藥敏基本原理、操作基本流程、我們的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)向大家匯報(bào)。（一）鑒定試驗(yàn)：微生物數(shù)碼分類原理（二）藥敏試驗(yàn)：MIC法（三）操作注意事項(xiàng)及我們的使用體會(huì)臨床常見細(xì)菌中英文名稱pae銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosaeco大腸埃希菌Escherichiacolisau金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureusss.aureussep表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidiskpn肺炎型肺炎克雷伯菌Klebsiella

pneumoniaess.pneumoniaaba鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter

baumanniiefa糞腸球菌Enterococcus

faecalishpi副流感嗜血桿菌Haemophilus

parainfluenzaeshl溶血葡萄球菌Staphylococcushaemolyticuspma嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas(Xantho.)maltophiecl陰溝腸桿菌Enterobactercloacaepmi奇異變形桿菌Proteusmirabilisefm屎腸球菌Enterococcus

faeciumpce洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia(Pseudo.)cepaciasap腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophyticusspn肺炎鏈球菌Streptococcuspneumoniae臨床常見細(xì)菌中英文名稱臨床常見細(xì)菌鑒定要點(diǎn)G+球菌G-球菌G-桿菌G+桿菌氧化酶，O/F腸桿菌科非發(fā)酵菌分枝桿菌菌落特征、革蘭/抗酸染色觸酶葡萄球菌+腸球菌-鏈球菌-觸酶，氧化酶奈瑟菌++布蘭漢菌++4糖：葡乳麥蔗DNA，N硝還臨床常見G+球菌鑒定要點(diǎn)葡萄球菌鏈球菌腸球菌觸酶+觸酶—觸酶—金葡溶血凝固酶+溶血葡溶血凝固酶-表皮葡不溶血凝固酶-肺炎鏈α溶血奧撲托辛S化膿鏈β溶血桿菌肽S無乳鏈β溶血CAMP+高鹽七葉苷阿拉伯糖屎腸阿+糞腸阿-發(fā)酵菌氧化/發(fā)酵，+/+腸桿菌科例外：非發(fā)酵菌氧化/發(fā)酵，+/-不動(dòng)桿菌：G-球桿菌；嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌：菌落黃色。例外：發(fā)酵菌氧化/發(fā)酵，+/+弧菌屬非發(fā)酵菌氧化/發(fā)酵，+/-假單胞菌屬氧化酶-氧化酶+臨床常見G-桿菌鑒定要點(diǎn)O/F，KIA腸桿菌科生化O/F非發(fā)酵菌生化血清學(xué)鑒定O157：H7、沙門菌屬、志賀菌屬血清學(xué)鑒定（一）鑒定試驗(yàn)：微生物數(shù)碼分類原理目前大多數(shù)微生物鑒定系統(tǒng)以數(shù)值分類法為基礎(chǔ)。篩選多個(gè)具有代表性的生化反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)合臨床常見屬種病原菌生化反應(yīng)結(jié)果構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)由許多細(xì)菌條目組成，每個(gè)條目代表一個(gè)細(xì)菌種或一個(gè)細(xì)菌生物型。將細(xì)菌生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)模式，得到待鑒定菌的編碼，經(jīng)查閱編碼檢索本或電腦分析系統(tǒng)，得到待鑒定菌的名稱及可能性(ID%)。數(shù)據(jù)庫(kù)中生化反應(yīng)主要包括:細(xì)菌對(duì)碳水化合物（多種糖或醇）、氨基酸（賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸等）、蛋白質(zhì)（靛基質(zhì)試驗(yàn)、硫化氫利用等試驗(yàn)）、無機(jī)鹽類（硝酸鹽還原試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、丙二酸鹽試驗(yàn)等）的代謝能力、多種酶類（尿素酶試驗(yàn)、淀粉酶試驗(yàn)等）存在與否等特性；上述反應(yīng)常導(dǎo)致反應(yīng)體系pH值變化或產(chǎn)生顯色物質(zhì)，加入合適的酸堿指示劑或顯示劑可顯示結(jié)果的陽性或陰性。部分儀器在生化反應(yīng)的底物上標(biāo)記熒光物質(zhì)，生化反應(yīng)如為陽性，則可激發(fā)熒光，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，可以更快速地得到生化反應(yīng)結(jié)果，也可以篩選不能通過顯色判斷結(jié)果的生化試驗(yàn)，可以選擇更多的生化反應(yīng)，是結(jié)果更加準(zhǔn)確。目前全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀器可自動(dòng)定時(shí)檢測(cè)每一生化反應(yīng)的結(jié)果。腸桿菌科等生長(zhǎng)快速的細(xì)菌常在4~6h內(nèi)得出鑒定結(jié)果，其他常見屬種細(xì)菌也常在6~10h內(nèi)得出鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)中生化反應(yīng)被分為多個(gè)組，一般三個(gè)生化反應(yīng)為1組，每種生化反只有“陽性”和“陰性”結(jié)果，計(jì)算機(jī)識(shí)別為“1”和“0”二進(jìn)制數(shù)字。每種生化反應(yīng)在組合中的位置不同,陽性值也不同，每組第1、2和3位的生化反應(yīng)如陽性，則分別計(jì)為4、2、1，陰性值為0，將3個(gè)反應(yīng)的值相加，即可能為0~7之間的1個(gè)數(shù)值。不同鑒定系統(tǒng)篩選的生化反應(yīng)總數(shù)及組合不同，如選用30個(gè)生化反應(yīng)，共10組，得到10位數(shù)的生物數(shù)碼，有時(shí)還需增加補(bǔ)充試驗(yàn)，即獲得11位生物數(shù)碼，系統(tǒng)將最后一次判讀的結(jié)果所得到的生物數(shù)碼，與菌種數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)生物模型比較，得出鑒定結(jié)果及可能性(ID%)。每種細(xì)菌對(duì)不同生化反應(yīng)為陽性結(jié)果的幾率可能不同,某種細(xì)菌可能出現(xiàn)的各種編碼相應(yīng)幾率之和等于1。如果一個(gè)編碼只對(duì)應(yīng)一種細(xì)菌,無論幾率大小,為該種細(xì)菌的可能性(ID%)均為99.99%。如果一個(gè)編碼對(duì)應(yīng)兩種或以上種類的細(xì)菌,應(yīng)計(jì)算每種細(xì)菌出現(xiàn)幾率所占的百分比ID%。如ID%≥99%,為該種菌的可能性非常大。如ID%≥90%,為該種菌的可能性較大。如ID%≥80%,為該種菌的可能性也較大,但需補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)一步確證。如ID%<80%，則一般無法準(zhǔn)確區(qū)分菌種，必須增加多個(gè)補(bǔ)充試驗(yàn)才可得出準(zhǔn)確結(jié)果。鑒定卡（板）是系統(tǒng)的工作基礎(chǔ)，鑒定卡（板）上都附有條形碼，上機(jī)前經(jīng)條形碼掃描器掃描后可被系統(tǒng)識(shí)別，以防標(biāo)本混淆。G-菌鑒定卡（板）（鑒定臨床常見腸桿菌科、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌等）;G+菌鑒定卡（板）（鑒定臨床常見葡萄球菌屬、腸球菌屬、需養(yǎng)芽孢桿菌等）;厭氧菌鑒定卡（板）；苛氧菌鑒定卡（板）（鑒定奈瑟氏菌屬、嗜血桿菌屬、其它苛氧菌）;酵母菌鑒定卡（板）。儀器一般都配有標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)蠞舛缺葷醿x，挑取適量菌落混懸于配套的鑒定肉湯管中，測(cè)定菌液濃度，調(diào)至合適濃度后，通過自動(dòng)接種器，或直接將菌液接種入鑒定卡（板）。鑒定卡（板）接種菌液后，放入孵箱/讀數(shù)器中進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè)。檢測(cè)系統(tǒng)每隔一定時(shí)間對(duì)鑒定卡（板）上每孔透光度或熒光物質(zhì)的變化進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)定值轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)將這些電信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)碼，在數(shù)據(jù)庫(kù)與已儲(chǔ)存的菌株資料比較，推斷出待檢菌的菌種及可能性(ID%)。數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)與孵箱/讀數(shù)器連接，可控制孵箱溫度、自動(dòng)定時(shí)讀數(shù)、數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換及分析處理，與打印機(jī)連接，可打印最終的鑒定及藥敏結(jié)果。最簡(jiǎn)單的選板操作：僅需革蘭染色G+球菌及桿菌，152種G-發(fā)酵菌及非發(fā)酵菌，176種PhoenixTM100鑒定板

革蘭陽性板、革蘭陰性板生化反應(yīng)組合革蘭氏陽性菌鑒定板革蘭氏陰性菌鑒定板鑒定部分：51孔鑒定實(shí)驗(yàn),改良經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，45-46種反應(yīng)底物同時(shí)雙重鑒定方法：顯色＋熒光檢測(cè)無需附加實(shí)驗(yàn)與試劑快速而可靠的鑒定檢測(cè)原理熒光檢測(cè)靈敏度更高！鑒定速度更快！雙重方法，結(jié)果更準(zhǔn)確！鑒定檢測(cè)模式檢測(cè)板每20分鐘被檢測(cè)一次Green,blue

andred檢測(cè)顯色反應(yīng)UVlight檢測(cè)熒光反應(yīng)反應(yīng)panel兩種檢測(cè)方法的比較比色：吸收光光度法比較的是兩個(gè)較大的光值熒光：發(fā)射光探測(cè)比較的是一個(gè)比較小的發(fā)射光和空白值通常前者的最低探測(cè)值是后者的1000倍以上，即熒光檢測(cè)的靈敏度是比色的1000倍。Phoenix-100不僅采用了傳統(tǒng)的比色法，還把熒光法引入細(xì)菌鑒定，拓寬了分析方法，增加了底物的選擇范圍！儀器判讀結(jié)果儀器自動(dòng)記錄每次判讀的每個(gè)反應(yīng)孔的結(jié)果。將反應(yīng)結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進(jìn)行比較。當(dāng)兩次結(jié)果沒有差別，則該反應(yīng)結(jié)束。動(dòng)態(tài)檢測(cè)，實(shí)時(shí)報(bào)告結(jié)果：依時(shí)間而變的數(shù)據(jù)庫(kù)：2、3、4、6、12小時(shí)，依據(jù)每個(gè)測(cè)試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖”，如獲得足夠的信息，則第一時(shí)間給出鑒定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)菌量下,可信度＞90％，給出唯一鑒定結(jié)果?？尚哦龋?0％，結(jié)果具有唯一性，無需附加實(shí)驗(yàn)。Phoenix100鑒定結(jié)果明確且可信?。ǘ┧幟粼囼?yàn)：MIC法臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中藥敏試驗(yàn)主要應(yīng)用微量稀釋法和K-B紙片擴(kuò)散法，微生物藥敏試驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化主要應(yīng)用微量稀釋法。目前臨床常應(yīng)用的微生物自動(dòng)鑒定及藥敏試驗(yàn)儀器，常利用鑒定卡（板）和藥敏試驗(yàn)卡（板），同時(shí)進(jìn)行待檢菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)。自動(dòng)化藥敏試驗(yàn)使用藥敏試驗(yàn)卡（板）進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)質(zhì)就是微型化的肉湯稀釋試驗(yàn)。根據(jù)不同的藥物對(duì)不同菌種最低抑菌濃度MIC（minimalinhibitoryconcentration）的不同，每一種藥物一般選用3種或以上不同藥物濃度，每一藥敏試驗(yàn)卡（板）可同時(shí)檢測(cè)約20種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。不同儀器檢測(cè)藥敏試驗(yàn)中細(xì)菌情況的原理不同，常有光電比濁法測(cè)定細(xì)菌濃度、熒光標(biāo)記法測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化、氧化還原指示劑檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物等方法。經(jīng)數(shù)小時(shí)孵育后，每隔一定時(shí)間自動(dòng)測(cè)定每一藥敏試驗(yàn)孔中細(xì)菌生長(zhǎng)情況，與細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照孔的結(jié)果進(jìn)行比較計(jì)算出生長(zhǎng)率。不同儀器的生產(chǎn)廠家均已經(jīng)對(duì)大量已知MIC值的不同菌種生長(zhǎng)率進(jìn)行測(cè)定，得到與不同MIC值相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，儲(chǔ)存在藥敏試驗(yàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中。將藥敏試驗(yàn)卡（板）中各測(cè)定孔的生長(zhǎng)率在數(shù)據(jù)庫(kù)中比較分析，可得到最低抑菌濃度MIC值，參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)、歐盟標(biāo)準(zhǔn)（CASFM）和全球判斷標(biāo)準(zhǔn)（GLOBAL），判斷最終結(jié)果敏感“S”、中度敏感“MS(I)”和耐藥“R”，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行解讀。MIC稀釋法一般在瓊脂或肉湯中將抗菌藥物系列對(duì)倍稀釋，定量接種待檢菌，35℃培養(yǎng)18至24小時(shí)后觀察結(jié)果；抑制檢測(cè)菌肉眼可見生長(zhǎng)的最低藥物濃度，即最小抑菌濃度；MIC稀釋法結(jié)果以MIC（μg/ml）數(shù)值報(bào)告，數(shù)值越小越敏感，與K-B法相反。MIC稀釋法藥敏檢測(cè)鑒定部分藥敏部分：85孔藥敏實(shí)驗(yàn)比濁＋氧化還原（專利）實(shí)測(cè)倍比稀釋MIC值藥物種類與濃度梯度最多耐藥機(jī)制檢測(cè)同步進(jìn)行封閉式設(shè)計(jì)，安全無泄漏藥敏測(cè)試

檢測(cè)反應(yīng)孔內(nèi)微生物生長(zhǎng)情況濁度（傳統(tǒng)方法）：微生物生長(zhǎng)形成小顆粒和聚集成團(tuán)塊

氧化還原作用（BD專利技術(shù)）：通過指示劑顏色變化檢測(cè)微生物的新陳代謝

藥敏測(cè)試原理：兩種檢測(cè)方法的比較對(duì)于生長(zhǎng)較慢的細(xì)菌采用氧化還原法可提高藥敏實(shí)驗(yàn)的速度。當(dāng)細(xì)菌非均勻（片狀或沉淀）生長(zhǎng)時(shí)，采用比濁法往往會(huì)出現(xiàn)偏差。而氧化還原法可以彌補(bǔ)這一不足，提高準(zhǔn)確性。Phoenix-100既采用傳統(tǒng)的比濁法，還把氧化還原法用于藥敏，突破了傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)的單一方法的局限。真正實(shí)測(cè)的倍比稀釋MIC值，符合CLSI標(biāo)準(zhǔn)！更多的藥敏測(cè)試孔85孔更多的測(cè)試藥物多達(dá)24種

更多的測(cè)試濃度多達(dá)7個(gè)測(cè)試濃度更準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果實(shí)際測(cè)量出來的MIC值

檢測(cè)板所含抗生素的濃度按倍比稀釋（符合經(jīng)典藥敏試驗(yàn)方法），通過比濁+氧化還原指示反應(yīng)實(shí)際測(cè)出，是真正的測(cè)量值。BDXpert微生物專家系統(tǒng)對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行解釋與修正，保證藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而指導(dǎo)臨床正確進(jìn)行抗感染治療專家規(guī)則來自于：已確定的標(biāo)準(zhǔn)（CLSI,DIN,SFM)，藥物研發(fā)單位的文獻(xiàn)資料，已廣為接受的文獻(xiàn)資料和經(jīng)驗(yàn)，持續(xù)更新，免費(fèi)升級(jí)SIR結(jié)果的解釋來自于專家系統(tǒng)規(guī)則的設(shè)置CLSI,DIN,SFM,Custom藥物分級(jí)規(guī)則天然耐藥和天然敏感規(guī)則耐藥標(biāo)記規(guī)則腸桿菌科：ESBL葡萄球菌：MRS,beta-內(nèi)酰胺酶腸球菌：VRE,HLGR,HLSR鏈球菌：LLPRSP、HLPRSP、MEFF、MLSb金葡菌：VRSA其它：HLSR、HLGR、HLKR（三）操作注意事項(xiàng)及我們的使用體會(huì)

試劑和耗材保存鑒定藥敏板、獨(dú)立密封包裝的鑒定肉湯和藥敏肉湯，即取即用，無需用戶配制。常溫保存，15至25℃，效期1年。建議放專門房間20℃，夏天開空調(diào)，冬天開暖風(fēng)。藥敏試驗(yàn)指示劑2至8℃冷藏，建議放4℃冰箱，冰箱內(nèi)放溫度計(jì)，每日監(jiān)測(cè)溫度。板條全密閉，確保生物安全基本流程：菌液配制及倒入板條

正確區(qū)分G+和G-板，與革蘭染色結(jié)果相符。可用鈍頭剪刀剪去包裝袋上端、剪開兩側(cè)，輕輕取出板條。

正確區(qū)分G+和G-板，分別標(biāo)記“+”和“-”。1.鑒定/藥敏板的加樣：1.1鑒定/藥敏板啟封后放在加樣盤上，手只能接觸板的側(cè)面，千萬不要接觸正反面。MIC稀釋法，藥敏鑒定孔生化試驗(yàn)，細(xì)菌鑒定孔

如污染正反面，則影響相應(yīng)孔的檢測(cè)。1.鑒定/藥敏板的加樣：1.2使用無菌棉簽挑取純菌落至ID肉湯，混勻后等待10秒使氣泡消失，使用CrystalSpec比濁儀調(diào)整菌液濃度，以0.5最佳，0.5-0.6McFarland之間均可。用滅菌棉簽將平板上菌落混懸于ID管中；在旋渦混合器上充分混勻；菌液一定要混勻，否則影響鑒定和藥敏準(zhǔn)確性。建議利用血平板分純后，挑取菌落配制菌液，最好使用分純培養(yǎng)18~24h的新鮮菌落，不要超過48小時(shí)，如果標(biāo)本接種血平板后，不分純，則必須保證有足夠單個(gè)典型菌落，一般3~5個(gè)。1.3在AST肉湯中加一滴AST指示劑，從ID肉湯中轉(zhuǎn)移25μl菌液至AST肉湯，注意提前半小時(shí)以上，將AST指示劑從冰箱中取出，放室溫平衡，用前混勻指示劑，注意加樣槍刻度是否為25μl，建議專槍專用，轉(zhuǎn)移25μl后，AST管上下輕輕顛倒10次混勻。垂直加一滿滴AST指示劑于AST管中，建議第一滴棄去，AST管加入指示劑后盡快使用，不要超過2小時(shí)。ID管，鑒定管AST管，藥敏管1.4將ID肉湯和AST肉湯分別倒入鑒定/藥敏板，將ID（鑒定）肉湯放在板左邊，將AST（藥敏）肉湯放在板右邊，用密封條封好，一定要蓋緊，菌液加入板條后盡快上機(jī)，不要超過半小時(shí)。如果上機(jī)的菌株較多，建議1個(gè)人配制菌液，1個(gè)人倒菌液及上機(jī)，以提高效率，但一定要注意在ID肉湯管上端，寫清菌株編號(hào)，在板條下端標(biāo)簽紙上，寫清菌株編號(hào)，從同一份標(biāo)本分離出多株菌，可在編號(hào)后加A、B、C等區(qū)分，千萬不要張冠李戴。專利自加樣技術(shù)2.鑒定/藥敏板信息輸入2.1將鑒定/藥敏板放轉(zhuǎn)移容器上，鑒定/藥敏板保持直立狀態(tài)，輕拿輕放，千萬不要掉地上；2.2按“寫入”鍵后，使用條碼器掃描鑒定/藥敏板的條形碼，輸入標(biāo)本自編號(hào)6位數(shù)，按“保存”鍵存盤；2.3如果為多個(gè)鑒定/藥敏板，則重復(fù)2.2步驟，直至信息全部輸入，最多可以上100個(gè)板。3.上機(jī)、孵育、檢測(cè)及取出3.1上機(jī)：a.全部輸入信息后，如儀器指示燈顯示處于檢測(cè)狀態(tài)（T），則需等檢測(cè)結(jié)束，一般為15分鐘；b.指示燈顯示儀器處于非檢測(cè)狀態(tài)時(shí)，才可開門；c.按