血液檢驗 17.血栓與止血檢驗的基本方法 下 學習資料

血栓與止血檢驗的基本方法（下）梁少聰南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院血液學檢驗教研室12025/4/2止血與血栓檢驗【目的與要求】

1.掌握血栓與止血檢驗的基本方法的性質(zhì)、原理、結(jié)果判斷及分析。2.熟悉各試驗方法、臨床意義?！窘虒W內(nèi)容】

1.血栓與止血的篩查試驗：一期/初期止血的篩查試驗，二期止血的篩查試驗，纖溶活性的篩查試驗。2.血栓與止血的確診試驗：血管內(nèi)皮細胞的檢驗、血小板的檢驗、凝血因子的檢驗、抗凝物質(zhì)的檢驗、纖溶活性的檢驗。22025/4/2止血與血栓檢驗第十一章基本方法第一節(jié)血栓與止血的篩查試驗（P326）第二節(jié)血管內(nèi)皮細胞的檢驗第三節(jié)血小板的檢驗第四節(jié)凝血因子的檢驗第五節(jié)抗凝物質(zhì)的檢驗第六節(jié)纖溶活性的檢驗第七節(jié)血液流變學的檢驗32025/4/2止血與血栓檢驗篩查試驗4篩查試驗血管血小板凝血系統(tǒng)抗凝系統(tǒng)纖溶系統(tǒng)初期二期纖溶2025/4/2止血與血栓檢驗二期止血篩查試驗（一）凝血酶原時間（PT）（二）活化部分凝血活酶時間（APTT）（三）凝血時間（CT）（四）凝血酶時間（TT）（五）蛋白C活性依賴凝固時間（六）活化蛋白C抵抗試驗52025/4/2止血與血栓檢驗（五）蛋白C活性依賴凝固時間6激活劑APTT+APC2025/4/2止血與血栓檢驗NR（正?；戎担?(PCAT:PCAT/0)待測血漿xCF正常：APTT延長存在APC-R：不延長/延長不明顯臨床意義：PC、PS缺陷時，PC系統(tǒng)不能活化，PCAT縮短，NR減低。存在APC-R（抵抗APC滅活凝血因子）時，PCAT縮短，NR減低。內(nèi)源凝血系統(tǒng)？72025/4/2止血與血栓檢驗（六）活化蛋白C抵抗試驗8APTT+APC2025/4/2止血與血栓檢驗正常：APTT延長存在APC-R：不延長/延長不明顯臨床意義：存在APC抗體存在APC某種抑制物蛋白S缺乏基因突變導致FVa和FVIIIa不被滅活其他92025/4/2止血與血栓檢驗FactorVLeiden102025/4/2止血與血栓檢驗纖溶活性的篩查試驗一、血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物FDPs二、血漿D-二聚體三、血漿魚精蛋白副凝固試驗（3P）四、血漿優(yōu)球蛋白溶解時間112025/4/2止血與血栓檢驗PL激肽釋放酶12-PK鏈激酶、尿激酶內(nèi)激活外激活外源性激活纖溶活性的檢驗122025/4/2止血與血栓檢驗13IIa纖維蛋白溶解系統(tǒng)

2025/4/2止血與血栓檢驗一、FDPs的檢測Fibrinogendegradationproducts檢測方法：利用FDPs的抗原性膠乳凝集法免疫比濁法ELISA142025/4/2止血與血栓檢驗臨床意義：顯著升高：DIC，DVT，APL，原發(fā)性纖溶亢進，溶栓治療。輕度升高：肝腎疾病，外傷，術(shù)后，某些惡性腫瘤、急性感染。FDPs的檢測152025/4/2止血與血栓檢驗二、D-dimer的檢測檢測原理：檢測方法的建立有賴于不同的抗D-Dimer的單克隆抗體抗原抗體反應檢測方法：膠乳凝集法（定性或半定量）免疫比濁法（儀器法）ELISA膠體金免疫滲透試驗162025/4/2止血與血栓檢驗172025/4/2止血與血栓檢驗D-dimer的檢測臨床應用：升高：血栓前狀態(tài)與血栓性疾病，eg.DVT、DIC、肺栓塞、心梗、腦梗等，妊娠期原發(fā)性與繼發(fā)性纖溶鑒別：陰性基本可排除血栓形成治療監(jiān)測：溶栓治療有效時，D-dimer先增高，后逐漸下降；含量持續(xù)升高或下降緩慢，提示藥物用量不足。

DIC抗凝治療中，高水平的D-dimer持續(xù)下降，間接說明凝血過程在減緩或中止，治療有效；而持續(xù)升高說明治療無效。182025/4/2止血與血栓檢驗D-dimer與FDPs組合分析FDPs（－）D-D（－）FDPs（－）D-D（＋）FDPs（＋）D-D（－）FDPs（＋）D-D（＋）纖溶活性正常原發(fā)性纖溶DIC,溶栓治療FDPs假陰性、DD假陽性？192025/4/2止血與血栓檢驗三、血漿魚精蛋白副凝固試驗（3P）原理：繼發(fā)性纖溶時，形成可溶性FM-FDP復合物。魚精蛋白可使FM-FDP解離，F(xiàn)M-FM自行聚合沉淀，出現(xiàn)副凝固。plasmaprotamineparacoagulationtest.臨床意義：陽性：DIC早、中期陰性：DIC晚期，原發(fā)性纖溶亢進原發(fā)性與繼發(fā)性纖溶鑒別手工操作，現(xiàn)已少用。202025/4/2止血與血栓檢驗原理：血漿優(yōu)球蛋白組分含有Fg、PLG、PL和纖溶酶原活化劑。將優(yōu)球蛋白溶于緩沖液中，加入適量鈣或凝血酶溶液，F(xiàn)g轉(zhuǎn)成纖維蛋白，37℃觀察凝塊完全溶解所需時間臨床評價：↓見于原纖和繼纖亢進 ↑纖溶活性降低目前少用四、優(yōu)球蛋白溶解時間的檢測ELT212025/4/2止血與血栓檢驗第五節(jié)抗凝物質(zhì)的檢驗222025/4/2止血與血栓檢驗第五節(jié)抗凝物質(zhì)的檢驗一、生理性抗凝蛋白生理性抗凝蛋白血漿蛋白C血漿蛋白S血漿組織因子途徑抑制物二、病理性抗凝物質(zhì)血漿肝素及類肝素物質(zhì)血漿狼瘡抗凝物血漿凝血因子抑制物232025/4/2止血與血栓檢驗一、生理性抗凝蛋白243TFPI2025/4/2止血與血栓檢驗Interactionswithheparin252025/4/2止血與血栓檢驗抗凝血酶檢測Antithrombinactivity,AT:A發(fā)色底物法Antithrombinantigen,AT:Ag免疫火箭電泳ELISA2025/4/2止血與血栓檢驗26止血與血栓檢驗抗凝血酶活性AT:AAT活性檢測原理：待測血漿中的AT抑制已知過量的Thrombin或FXa，剩余的酶用發(fā)色底物法檢測。目前常用FXa。272025/4/2臨床意義AT升高：口服抗凝藥，急性出血期等AT降低：遺傳性AT缺乏:遺傳性AT缺陷，

易栓癥（thrombophilia)TypeⅠ,TypeⅡ，雜合子在40%-60%282025/4/2止血與血栓檢驗臨床意義獲得性AT缺乏：合成減少（肝病，早產(chǎn)兒）丟失過多（腎病綜合征）消耗增加（DIC）藥物誘導（L-門冬酰胺酶）

292025/4/2止血與血栓檢驗二、血漿蛋白C（PC）的檢測PC:activity,PC:A凝固法（APTT）發(fā)色底物法PC:antigen,PC:Ag免疫火箭電泳302025/4/2止血與血栓檢驗血漿蛋白C（PC）活性檢測凝固法-APTT312025/4/2止血與血栓檢驗發(fā)色底物法322025/4/2止血與血栓檢驗PC活性檢測方法評價凝固法影響因素多，如存在狼瘡抗凝物質(zhì)、FⅧ活性升高、FⅤ變異等。若存在APC抵抗時，血漿凝固時間假性縮短。可用乏PC的基質(zhì)血漿進行稀釋以糾正。確診遺傳性PC缺乏，活性測定應選發(fā)色底物法。332025/4/2止血與血栓檢驗血漿蛋白C（PC）抗原檢測ELISA342025/4/2止血與血栓檢驗臨床意義（PC）遺傳性PC缺陷純合子0-20%雜合子<50%其他疾?。ǜ尾?、VitK缺乏）口服抗凝要的影響口服香豆素類抗凝藥初期，由于PC比其他依賴VitK的凝血因子半衰期短，首先迅速減低，容易導致短暫、嚴重血液高凝狀態(tài)。可發(fā)生血栓栓塞或香豆素誘導的皮膚壞死352025/4/2止血與血栓檢驗遺傳性蛋白C（PC）缺陷362025/4/2止血與血栓檢驗（三）、血漿蛋白S（PS）檢測372025/4/2止血與血栓檢驗血漿蛋白S（PS）檢測382025/4/2止血與血栓檢驗檢測原理：freePS:activity,FPS:A凝固法：PTfreePS:antigen,FPS:Ag

膠乳凝集比濁法免疫火箭電泳血漿蛋白S（PS）檢測392025/4/2止血與血栓檢驗凝固法游離蛋白S活性FPS:A402025/4/2止血與血栓檢驗＋PSPSPSPSPSPSPSPSPS＋PSPSPSPSPSPSPSPS游離蛋白S抗原膠乳凝集比濁法C4bBP412025/4/2止血與血栓檢驗包被抗人PS的mAb兩種膠乳顆粒發(fā)生凝集游離蛋白S抗原ELISA422025/4/2止血與血栓檢驗臨床意義遺傳性PS缺陷TypeⅠ——insufficientquantityTypeII

——abnormalfunctionTypeIII——increasedclearanceoffreePS432025/4/2止血與血栓檢驗臨床意義獲得性PS缺陷肝臟疾病、VitK缺乏癥妊娠及新生兒的PS降低口服抗凝藥，PS降低442025/4/2止血與血栓檢驗（四）、組織因子途徑抑制物（TFPI）檢測TFPI:A發(fā)色底物法（Xa、TF/FⅦa）TFPI:AgELISA（雙抗體夾心）外源凝血途徑抑制劑，缺陷導致高凝狀態(tài)。多為獲得性缺乏，DIC、膿毒血癥、大手術(shù)等。增加可見于血管內(nèi)皮損傷性疾病，敗血癥、腎衰等。452025/4/2止血與血栓檢驗病理性抗凝物質(zhì)肝素、類肝素狼瘡抗凝物LAC凝血因子抑制物462025/4/2止血與血栓檢驗一、血漿肝素及類肝素樣物質(zhì)檢測檢測原理：1.甲苯胺藍糾正試驗——TT+甲苯胺藍2.血漿肝素定量——發(fā)色底物法，ⅩaUFH：inhibitionofthrombinandfactorXaLMWH：inhibitionoffactorXa472025/4/2止血與血栓檢驗482025/4/2止血與血栓檢驗肝素抗凝血酶的作用：肝素與ATⅢ的結(jié)合，肝素與凝血酶的直接結(jié)合肝素增強抗凝血酶-Ⅲ抑制FXa的作用：不需要肝素與FXa直接接觸臨床意義肝素增多：抗凝治療、體外循環(huán)、血液透析等。類肝素樣物質(zhì)增多：嚴重肝病、SLE、流行性出血熱、某些腫瘤。肝臟損傷：肝素在肝臟的降解作用減弱，患者可有較明顯出血癥狀。492025/4/2止血與血栓檢驗狼瘡抗凝物Russell蛇毒時間（RVVT）凝血因子缺陷：用正常血漿可糾正存在LAC：用高濃度磷脂可糾正502025/4/2止血與血栓檢驗XVII纖維蛋白原纖維蛋白PL、Ca2+蛇毒試劑臨床意義LAC是一組抗磷脂或磷脂與蛋白（β2-GPI和凝血因子）復合物的抗體，可以干擾磷脂依賴的止血反應和體外凝血試驗（APTT/SCT/RVVT等）。血漿LAC陽性，可見于自身免疫性疾病（SLE）、病毒感染、復發(fā)性流產(chǎn)等。體外試驗產(chǎn)生抗凝效應，體內(nèi)促進血栓形成2025/4/2止血與血栓檢驗51凝血因子抑制物糾正試驗混合血漿法2025/4/2止血與血栓檢驗52常見8因子抑制物時間依賴性2025/4/2止血與血栓檢驗53篩查試驗確診試驗第六節(jié)纖溶活性的檢驗542025/4/2止血與血栓檢驗五、血漿纖溶酶原（PLG）的檢測檢測原理：PLG:A發(fā)色底物法PLG:AgELISA552025/4/2止血與血栓檢驗臨床意義降低：合成減少：肝實質(zhì)損傷消耗增多：DIC、溶栓治療、原發(fā)性纖溶亢進等異常PLG血癥：活性降低，含量一般正常遺傳性PLG缺乏：極少見升高：某些惡性腫瘤、糖尿病方法評價：發(fā)色底物法簡便、快速；影響因素較多，欠靈敏。562025/4/2止血與血栓檢驗血漿組織型纖溶酶原活化劑（t-PA）檢測檢測原理：t-PA:A發(fā)色底物法t-PA:AgELISA572025/4/2止血與血栓檢驗血漿纖溶酶原活化抑制劑（PAI）檢測檢測原理：PAI:A發(fā)色底物法PAI:CSDS利用t-PA-PAI形成1:1無活性復合物582025/4/2止血與血栓檢驗t-PA/PAI-1系統(tǒng)臨床意義：PAI減少，可增高出現(xiàn)風險PAI增多，可導致血栓風險術(shù)前血漿PAI-1水平與術(shù)后DVT發(fā)生有顯著相關(guān)性。592025/4/2止血與血栓檢驗第七節(jié)血液流變學檢驗2025/4/2止血與血栓檢驗60全血粘度檢測毛細管粘度計檢測法旋轉(zhuǎn)式粘度計檢測法臨床評價：增高：冠心病、心肌梗死、高血壓病、腦血栓形成、深靜脈血栓形成、糖尿病、高脂血癥、惡性腫瘤、肺心病、真紅、MM、燒傷等。減低：見于各種類型貧血2025/4/2止血與血栓檢驗61血漿粘度檢測原理：毛細管粘度計檢測法：根據(jù)一定體積的受檢血漿流經(jīng)一定半徑和一定長度的毛細管所需的時間與該管兩端壓力差計算出粘度值。參考值：（1.64±0.05）mPa?s臨床評價：升高：所有引起血漿蛋白質(zhì)異常增高的疾病均可導致血漿粘度升高，如MM、原發(fā)性巨球蛋白血癥、纖維蛋白原增高癥、糖尿病、高脂血癥、某些膠原性疾病等。2025/4/2止血與血栓檢驗62紅細胞變形性檢測原理：微孔過濾法：用緩沖液將受檢血配制成一定容積的10％紅細胞懸液，測定通過5μm直徑微孔膜所需的時間，與對比液通過的時間比較，計算出紅細胞的濾過指數(shù)，即紅細胞的變形性。濾過指數(shù)越高，變形性越差。參考值：0.29±0.10臨床意義：增高：見于紅細胞變形性減低的疾病，如遺傳性球形紅細胞增多癥、珠蛋白生成障礙性貧血、心肌梗死、腦血栓形成、高血壓、冠心病、高血脂、糖尿病等。2025/4/2止血與血栓檢驗63止凝血試驗的自動化2025/4/2止血與血栓檢驗64全自動凝血分析儀2025/4/2止血與血栓檢驗651.生物學方法2.生物化學方法3.免疫方法止凝血試驗的自動化生物學方法血漿中凝血因子激活，纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，發(fā)生物理特性變化透射比濁法散射比濁法光學法：血漿透明度的改變電流法：纖維蛋白的導電性粘度法：纖維蛋白的產(chǎn)生，血漿粘度增加磁珠法儀器設計基礎儀器設計原理662025/4/2止血與血栓檢驗舉例：粘度法PT、APTT672025/4/2止血與血栓檢驗生物化學方法激活的凝血因子皆為酶，可激活特異的分解底物而顯色

對酶的檢測：即在含酶的樣品中直接加入發(fā)色底物。對酶原的檢測：必須先用激活劑將酶原激活使其位點暴露,再加入基質(zhì),使酶將發(fā)色物質(zhì)上的顯色物質(zhì)(PNA)裂解下來對酶抑制物檢測：首先往加入待測樣品加入過量對應酶，中和該抑制物剩余的酶可裂解基質(zhì)產(chǎn)生

PNA儀器設計原理儀器設計基礎止凝血試驗的自動化682025/4/2止血與血栓檢驗發(fā)色底物首先人工合成可以被待測凝血活酶催化裂解的化合物，且化合物連接上產(chǎn)色物質(zhì)，在檢測過程中產(chǎn)色物質(zhì)可被解離下來，使被檢樣品中出現(xiàn)顏色變化，根據(jù)顏色變化可推算出被檢凝血活酶的活性。產(chǎn)色物質(zhì)一般選用連接對硝基苯胺（PNA）。游離的PNA呈黃色，其測定波長選用405nm。速率法、終點法2025/4/2止血與血栓檢驗692025/4/2止血與血栓檢驗70舉例2:

蛋白C檢測(PC)舉例1:

凝血酶檢測

凝血酶（血漿）發(fā)色底物

多肽+

PNA

加過量的激活劑蛋白C活化蛋白C

發(fā)色底物

多肽+

PNA止凝血試驗的自動化712025/4/2止血與血栓檢驗止凝血試驗的自動化舉例3:

抗凝血酶檢測AntithrombinHeparinThrombin(過剩量)（酶）（血漿）Heparin＋AntithrombinIIIHeparinThrombin(過剩量)Thrombin(殘存部分)（失活）AAAAAA（合成基質(zhì)）AAAAAA比色定量（405nm）+++pNApNAAntithrombin722025/4/2止血與血栓檢驗免疫學方法利用抗凝（凝血）因子與抗體結(jié)合反應，血漿發(fā)生濁度變化透射比濁法散射比濁法直接濁度分析乳膠比濁分析儀器設計基礎儀器設計原理止凝血試驗的自動化732025/4/2止血與血栓檢驗散色光比濁法透射光比濁法信號

激發(fā)光透射光激發(fā)光信號

散射法信號可以通過提高激發(fā)光的強度人為增強。散射光比濁的靈敏度是透射光比濁法的100倍。舉例:

(D-Dimer)乳膠標記抗體+血漿D-Dimer反應止凝血試驗的自動化742025/4/2止血與血栓檢驗小結(jié)2025/4/2止血與血栓檢驗7576篩查試驗確證試驗一期血管內(nèi)皮細胞BT、PLT#、CRT、CT(栓塞時間)vWF、ET-1、TM、PGI2代謝物血小板PLT粘附、聚集、糖蛋白（