重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修33

為了棉花姓“中國(guó)”1992年，一場(chǎng)史無前例的棉鈴蟲災(zāi)害吞噬著中國(guó)的棉田，我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)遭遇滅頂之災(zāi)；國(guó)外公司拒絕出售抗蟲棉核心技術(shù)，到1999年外國(guó)抗蟲棉已占領(lǐng)我國(guó)95%的棉花市場(chǎng)份額，國(guó)內(nèi)棉花品種市場(chǎng)迅速流失。1998年中棉所成功培育出我國(guó)第一個(gè)國(guó)審抗蟲雜交棉新品種——中棉所29，使低齡棉鈴蟲的死亡率超過90%；2002年成功培育出我國(guó)第一個(gè)雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種——中棉所41，該品種能夠緩解棉鈴蟲抗藥性，我國(guó)成為世界第二個(gè)擁有抗蟲基因自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)家！第3章基因工程

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。

（1）原理：

（2）操作水平：

（3）操作環(huán)境：

（4）操作對(duì)象：

（5）結(jié)果：基因重組。分子水平。生物體外?；?。賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。

（6)優(yōu)點(diǎn)：定向改造生物體的性狀，目的性強(qiáng)（與誘變育種相比）育種周期短，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙（與雜交育種相比）2.圖解“基因工程實(shí)質(zhì)”轉(zhuǎn)移A生物B生物螢火蟲普通動(dòng)植物發(fā)光基因第1節(jié)基因工程的工具

第三章基因工程本節(jié)聚焦:重組DNA技術(shù)的3種基本工具是什么？

它們各具什么作用？基因工程載體需要具備什么條件？

重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具“分子手術(shù)刀”準(zhǔn)確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞基因工程誕生的理論基礎(chǔ)1.拼接的基礎(chǔ)：2.表達(dá)的基礎(chǔ)：(1)DNA的基本組成單位都是

。(2)DNA分子都遵循

原則(3)雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的

。四種脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)雙螺旋結(jié)構(gòu)(1)基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。(3)生物界共用一套遺傳密碼。1.為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？2.為什么一種生物的基因可以在另一種生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)？1.簡(jiǎn)稱：限制酶2.來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。一、限制性內(nèi)切核酸酶——分子手術(shù)刀3.限制酶的命名：

用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語，以此來表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRI。兩種常用的限制酶：EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個(gè)限制酶；SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個(gè)限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”4.作用(特點(diǎn))：

識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵5.作用部位：特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A磷酸二酯鍵（特異性）你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身安全。

所以，簡(jiǎn)單來說：限制酶在原核生物中起到的作用為：切割外源DNA使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的P74拓展應(yīng)用：試推測(cè)限制酶為什么不會(huì)切割自身的DNA？一、限制性內(nèi)切核酸酶——分子手術(shù)刀提示：含某種限制酶的細(xì)菌的DNA分子不具備這種限制酶的識(shí)別序列，或者甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到了限制酶所識(shí)別序列的堿基上（識(shí)別序列已被修飾），使限制酶不能將其切開。思考仔細(xì)觀察以下四種限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。6.限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)：7.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——_________和_______黏性末端平末端①當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的___________將DNA分子的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是__________；②當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的________切開時(shí)，產(chǎn)生的是______；中軸線兩側(cè)黏性末端中軸線處平末端一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”12

黏性末端

黏性末端只能識(shí)別5‘GAATTC3’序列，并在G和A之間切開。被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的切割：平末端平末端SmaI限制酶的作用：只能識(shí)別5‘CCCGGG3’序列，并在C和G之間切開。當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因……TACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因1.要想獲得某個(gè)特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？2.如果把兩種來源不同的DNA用同種限制酶來切割，會(huì)怎樣？要切2個(gè)切口，產(chǎn)生4個(gè)黏性(平)末端。會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端思考思考與討論4.請(qǐng)寫出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？提示

如圖同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同，不同的限制酶可能會(huì)形成相同的黏性末端。5.以下黏性末端是由__種限制酶作用產(chǎn)生的3學(xué)以致用思考與討論3.請(qǐng)結(jié)合限制酶的作用特點(diǎn)，回答以下問題：(1)限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能(2)請(qǐng)結(jié)合右圖，推斷限制酶切割一次可斷開幾個(gè)磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少游離的磷酸基團(tuán)？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？消耗幾分子水？消耗2分子水。斷開2個(gè)磷酸二酯鍵；產(chǎn)生2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)；產(chǎn)生2個(gè)黏性末端；6.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，已知BamHⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—酶切結(jié)果：BamHⅠ，

。Sau3AⅠ，

。形成一個(gè)切口形成兩個(gè)DNA片段使用

（限制酶）提取目的基因Sau3AⅠG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)把兩種來源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？思考

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G思考兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來二、分子縫合針—DNA連接酶1.作用：注意：用DNA連接酶連接兩個(gè)片段之間的磷酸二酯鍵不是連接氫鍵（氫鍵的形成不需要酶的催化）DNA連接酶能夠?qū)NA片段連接起來2.種類：⑴E.coliDNA連接酶：⑵T4DNA連接酶：連接平末端效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶拓展：幾種相關(guān)酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對(duì)之間的氫鍵將DNA切成兩個(gè)片段磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈5.以下黏性末端是由__種限制酶作用產(chǎn)生的3學(xué)以致用思考與討論3.請(qǐng)結(jié)合限制酶的作用特點(diǎn)，回答以下問題：(1)限制酶能切開RNA分子的磷酸二酯鍵嗎？不能(2)請(qǐng)結(jié)合右圖，推斷限制酶切割一次可斷開幾個(gè)磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少游離的磷酸基團(tuán)？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？消耗幾分子水？消耗2分子水。斷開2個(gè)磷酸二酯鍵；產(chǎn)生2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)；產(chǎn)生2個(gè)黏性末端；質(zhì)粒:將外源基因送入受體細(xì)胞,使目的基因能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行大量復(fù)制。1.作用：動(dòng)植物病毒:噬菌體:2.種類：將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)植物細(xì)胞將外源基因?qū)氪竽c桿菌等細(xì)胞動(dòng)物病毒噬菌體三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”3.作為載體需具備的條件（1）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)目的：供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或整合到受體DNA上，

隨受體DNA同步復(fù)制。（3）常有特殊的標(biāo)記基因

（如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等）目的：便于重組DNA分子的鑒定和篩選。（4）對(duì)受體細(xì)胞無害，大小合適、方便操作。有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。不能被酶切破壞能復(fù)制，并帶著插入的目的基因一起復(fù)制是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我

能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。有切割位點(diǎn)最常用的載體

—質(zhì)粒：復(fù)制真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過

改造的。人工30標(biāo)記基因的篩選原理：載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。（據(jù)圖請(qǐng)嘗試描述篩選的過程）關(guān)鍵點(diǎn)撥培養(yǎng)基中有幾種類型的大腸桿菌？什么樣的大腸桿菌能夠在該培養(yǎng)基上存活并繁殖？基因工程中的載體細(xì)胞膜上的載體蛋白本質(zhì)作用基因工程中的載體與細(xì)胞膜上的載體蛋白的區(qū)別DNA分子蛋白質(zhì)攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞中，并在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制運(yùn)載要進(jìn)出細(xì)胞的特定物質(zhì)思維拓展6.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，已知BamHⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—酶切結(jié)果：BamHⅠ，

。Sau3AⅠ，

。形成一個(gè)切口形成兩個(gè)DNA片段使用

（限制酶）提取目的基因Sau3AⅠ…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重組DNA分子重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。注意：同種限制酶不一定是同一種限制酶(比如同兩種）。要保證切割目的片段和載體用的酶相同，這樣才能進(jìn)行下一步的拼接?！璗ATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5.從以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子時(shí)，需用限制酶切

割___次此DNA分子，斷

個(gè)磷酸二酯鍵,產(chǎn)生____個(gè)末端,出現(xiàn)____個(gè)游離

的磷酸基團(tuán)。6.切割目的基因和載體時(shí)，需要用_______限制酶,目的是_______________7.目的片段翻轉(zhuǎn)過來，可以連接嗎？____8.目的片段可以自身環(huán)化嗎？_____9.如何防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接到載體：244同種產(chǎn)生相同的黏性末端可以可以用不同的限制酶（通常兩種）切割目的基因的兩側(cè)及質(zhì)粒，使之產(chǎn)生不同的黏性末端。重組DNA分子4【例1】①用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。②構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，最好選擇限制酶BamHⅠ、HindⅢ處理質(zhì)粒、外源DNA，這樣做的目的是

。SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒中的抗性基因以及破壞目的基因確保目的基因與質(zhì)粒的正確連接防止目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化及防止目的基因反向連接到載體【思考3】用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)(3)選擇限制酶切割位點(diǎn)的基本原則：

①切割目的基因時(shí)：

。

②切割質(zhì)粒時(shí)：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定1、實(shí)驗(yàn)原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA能溶于物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液在一定溫度下（沸水浴），DNA被二苯胺試劑染成藍(lán)色初步分離DNA和蛋白質(zhì)溶解DNA鑒定DNADNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菜花和豬肝等。

（注意：不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）(1)選材：(2)試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用2、材料用具實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定稱取洋蔥，切碎，放入研缽，倒入研磨液，充分研磨。破碎細(xì)胞目的：裂解細(xì)胞，釋放DNA過濾在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取上清液；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取上清液。問題1:過濾能否用濾紙代替紗布？

不可以。因?yàn)镈NA會(huì)被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。問題2:此步驟獲得的上清液中可能含有哪些細(xì)胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等。3、實(shí)驗(yàn)步驟低溫放置幾分鐘的作用

抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；抑制DNA分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；破碎細(xì)胞過濾DNA的析出在上清液中加入體積相等的預(yù)冷的酒精溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。問題3:此步驟的目的是？使蛋白質(zhì)等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。問題4：酒精預(yù)冷的作用？①可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定3、實(shí)驗(yàn)步驟破碎細(xì)胞過濾DNA的析出用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取沉淀物晾干。問題5：攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向目的？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子析出DNA實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定3、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組水浴加熱破碎細(xì)胞過濾DNA的析出DNA的鑒定將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min二苯胺2mol/L的NaCl空白對(duì)照：

在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。評(píng)價(jià)結(jié)果：（1）DNA純度看提取物顏色（2）DNA的量看與二苯胺反應(yīng)顏色的深淺現(xiàn)配現(xiàn)用！實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定3、實(shí)驗(yàn)步驟（1）你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。

本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。（2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？4、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)組水浴加熱5min，冷卻后對(duì)照組藍(lán)色

1.如果選用雞血細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如何快速破碎細(xì)胞？2.有時(shí)會(huì)在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？將雞血細(xì)胞置于蒸餾水中，待細(xì)胞漲破后，收集濾液。利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，不分解DNA，有利于DNA與蛋白質(zhì)分開。思考雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。(1)通過基因工程產(chǎn)生的變異是不定向的