DB15T 3551-2024呼倫貝爾羊種質資源冷凍保存技術規(guī)程

15I1呼倫貝爾羊種質資源冷凍保存技術規(guī)程2PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSolution)VS:玻璃化冷凍液(VitrifiedSolution)精子活力≥70%、密度≥0.8×10個/mL、畸形率≤15%,顏色為乳白色。離心處理后的精子，用I液稀釋至2×108個/毫升，在4℃冰箱平衡2h后，再用等體積II液稀釋至1在4℃條件下，將精液分裝到0.25mL細管中，另一端封口。5.7冷凍利用程序冷凍儀，在4℃~-35℃溫區(qū)，設置6℃/min的降溫速率；在-35℃~-100℃的溫區(qū)，設置20℃/min的降溫速率，然后投入液氮。將液氮倒入深度50cm以上的泡沫箱預冷10min,細管鋪放在取出凍精細管，室溫空氣浴5s,然后放置于40℃水浴10s取出，無菌紙巾擦干備用。36.1冷凍方法6.2卵母細胞選擇挑選至少有3層卵丘顆粒細胞的COCs,體外成熟24h后，在含0.1%(w/v)透明質酸酶中消化，去除卵丘顆粒細胞，挑選胞質均勻、折光性好、排出第一極體的裸卵。6.3試劑與溶液按照附錄A中表A.2規(guī)定的配方配制。將0.25mL細管加熱變軟后拉成為管壁內徑為0.2mm,管壁厚0.02mm的OPS管，冷卻后用手術刀片在其細端切開，細端長度約2cm。6.4.2凍前準備玻璃化冷凍液及使用器材在室溫25℃至少預熱30min,在培養(yǎng)皿中制作100μL～200μL的VS1和VS2液滴。保溫杯倒入液氮，15ml離心管壁扎眼兒、貼標簽、記錄羊只信息、卵母細胞質量和數(shù)量、日期等，放入保溫杯中，用于OPS的收集。將卵母細胞在VS1液中平衡30s,再移入VS2液中平衡不超過25s,將多枚卵母細胞及少量VS2吸入OPS中，投入液氮保存。解凍液及使用器材在室溫25℃至少預熱30min。在一個培養(yǎng)皿中加入2ml的TS1液，在另一個培養(yǎng)皿中分別制作200μLTS1、TS2、TS3解凍液微滴，置于37℃恒溫臺上，至少預熱10min。取出OPS,迅速插入盛有TS1的培養(yǎng)皿中，排出卵母細胞并計時。將卵母細胞移入TS1微滴孵育1min,然后移入TS2微滴孵育5min,再移入TS3微滴孵育5min,將卵母細胞在培養(yǎng)液中洗滌3～5次，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中復蘇0.5h~2h,備用。7胚胎冷凍保存7.1冷凍方法程序冷凍儀法。7.2胚胎選擇選擇1、2級桑葚胚至擴張囊胚，胚胎質量鑒定按照NY/T1674的規(guī)定執(zhí)行。47.3溶液配置按照附錄A中表A.3規(guī)定的配方配制。7.4標記按照DB15/T3401的規(guī)定執(zhí)行。7.5胚胎回收回收到裝有胚胎保存液并編號的平皿中。7.6洗滌胚胎在胚胎保存液滴中洗4次，放入做好標記的平皿中，30min內必須開始冷凍。胚胎在S1和S2液中平衡5min,在1.5M乙二醇中平衡10min。7.8冷凍按照DB15/T3401的規(guī)定執(zhí)行。7.9貯存將細管裝入相應的拇指管內，放入液氮罐中保存。胚胎細管從液氮中取出，空氣浴2s~3s后，放入32℃水浴10s。把胚胎放入T液中平衡5min,然后把胚胎移入胚胎保存液平衡5min,并洗3次，備用。5A.1精液冷凍保存溶液配方