DB12T 409-2009 蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗方法微生物法

DB12/T409-2009蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗方法微生物法Examinationofresidueofantibio天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院、太陽食品(天津)有限公司提出。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院負(fù)責(zé)解釋。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測技術(shù)研究院、太陽食品(天津)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張潔、汪曉冬、高亦軍、陳相富、趙用花、劉順榮。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。心1蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗方法微生物法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蛋與蛋制品中抗生素殘留檢驗的制樣及微生物抑制檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蛋(蛋黃部分)與蛋制品(蛋黃制品)中抗生素殘留篩選檢驗。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于蛋(蛋黃部分)與蛋制品(蛋黃制品)中抗生素殘留量的定量測定。修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。本方法根據(jù)抗生素對敏感菌的抑制作用，通過抑菌圈來判定是否含有抗生素。4.6游標(biāo)卡尺：測量范圍0mm~200mm,精度0.02mm,或抑菌圈測量儀。4.7平皿：直徑(86±1)mm,底部平整光滑，經(jīng)滅菌。4.11分析天平：感量0.1mg。4.12冰箱：0℃~8℃。4.13pH計：感量0.1。5.1.1藤黃微球菌MicrococcusluteusATCC9341,菌種的保存見附錄A。5.1.2枯草芽胞桿菌BacillussubtilisATCC6633,菌種的保存見附錄A。5.1.3蠟樣芽胞桿菌蕈狀變種BacilluscereusVar.mycoidesATCC11778,菌種的保存見附錄A。25.2.3檢測用培養(yǎng)基：抗生素培養(yǎng)基5號(AM5)、抗生素培養(yǎng)基8號(AM8)(配方見附錄B)。a)0.2mol/L檸檬酸溶液：稱取檸檬酸(C?H?O?)4.2g溶解在100mL蒸餾水中；b)0.5mol/L氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀(KOH)2.8g溶解在100mL蒸餾水中；c)混合液：0.2mol/L檸檬酸溶液和0.5mol/L氫氧化鉀溶液等量混合；d)檸檬酸一丙酮緩沖液體積比：混合液+丙酮+蒸餾水=35.3.1.2pH4.5磷酸緩沖液：稱取13.60g磷酸二氫鉀(KH?PO.)溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.3.1.3pH6.0磷酸緩沖液：稱取8.00g磷酸二氫鉀(KH?PO?)及2.00g磷酸氫二鉀(K?HPO?)溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.3.1.4pH8.0磷酸緩沖液：稱取0.52g磷酸二氫鉀(KH?PO?)及16.73g磷酸氫二鉀(K?HPO?)溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.3.2.1氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品10mg,用滅菌去離子水溶解并定容至1000Hg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用2d。5.3.2.2氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取250HL氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用pH6.0磷酸緩沖液稀5.3.2.3卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg,用滅菌去離子水溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用30d。5.3.2.4卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取400HL卡那霉素標(biāo)5.3.2.5土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg,用0.1mol/mLHCl溶解并定容置2℃~8℃冰箱中保存，可使用7d。5.3.2.7紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品10mg,用少量甲醇溶解，再用滅菌去離子水溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用30d。5.3.2.8紅霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取250HL的紅霉素6.1.1將鮮蛋去殼，去掉蛋清，將蛋黃在濾紙上滾動、擦拭，盡可能去掉殘留蛋清，取蛋黃，攪勻，備用。6.2稱取15.0g混勻的試樣于100mL三角瓶中，加入檸檬酸--丙酮緩沖液60mL,充分振蕩混勻，過濾，濾液備用。濾液應(yīng)確保其pH值在6.5～7.5之間。37.1.1藤黃微球菌ATCC9341菌懸液：將復(fù)蘇的菌種接種于盛有普通營養(yǎng)瓊脂的克氏瓶中，30℃±1℃培養(yǎng)18h~24h后，用滅菌生理鹽水完全洗下菌苔，制成菌懸液。置2℃~8℃冰箱中可保存15d。營養(yǎng)瓊脂的克氏瓶中，30℃±1℃培養(yǎng)7d,鏡檢芽胞數(shù)達(dá)到80%以上(如果達(dá)不到，可再培養(yǎng)數(shù)日，如培養(yǎng)10d以上，芽胞數(shù)仍達(dá)不到要求，菌種可能變異，不可使用。)|,用滅菌生理鹽水完全洗下菌苔，使其懸浮于生理鹽水中，65℃±1℃水浴加熱30min,經(jīng)3000r/min離心20min,棄去上清液，如此重復(fù)洗滌芽胞兩次，然后用適量滅菌生理鹽水制成菌懸液。置2℃~8℃冰箱中可保存30d。把不同濃度藤黃微球菌ATCC9341菌懸液加入AM5培養(yǎng)基中，30℃±1℃培養(yǎng)18h后，使0.025Hg/mL氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)工作液可產(chǎn)生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而獲得最適宜菌懸液用量。將經(jīng)過確認(rèn)的適宜濃度的菌懸液無菌吸取1mL加到溶化后冷卻至50℃左右的滅菌AM5培養(yǎng)基8mL中，充分混勻，保持水平使其凝固。制備好的平板置2℃~8℃冰箱中可保存2d～3d.那霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液可產(chǎn)生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而獲得最適宜菌懸液用量。將經(jīng)過確認(rèn)的適宜濃度的菌懸液無菌吸取1mL加到溶化后冷卻至50℃左右的滅菌AM?培養(yǎng)基8mL中，充分混勻，保持水平使其凝固。制備好的平板置2℃~8℃冰箱中可保存2d～3d。土霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液可產(chǎn)生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而獲得最適宜菌懸液用量。將經(jīng)過確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以檸檬酸-丙酮緩沖液作空白對照，待濾紙干后，把濾紙片以適當(dāng)間隔置于平板上，每個平板最多不超過6片，用無菌鑷子輕壓使其固定，冷藏放置30min,再以30℃±1℃培養(yǎng)，18h后觀察如樣液在三種平板上均無抑菌圈，標(biāo)準(zhǔn)工作液的抑菌圈達(dá)到(14±1)mm,即報告“陰性”;如樣液在三種平板中任一平板上呈現(xiàn)抑菌圈，抑菌圈直徑小于12mm,大于10mm;檸檬酸-丙酮緩a)β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林):0.025mg/kg;4b)氨基糖苷類(卡那霉素):0.2mg/kg;c)四環(huán)素類(土霉素):0.05mg/kg;d)大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素):0.05mg/kg。5(規(guī)范性附錄)普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)30℃±1℃培養(yǎng)18h~24h后，用滅菌脫脂棉塞密封冷藏保存。每隔30d至45d傳代一次。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)30℃±1℃培養(yǎng)18h~24h后，分別接種于含有10%~20%脫脂乳的普通營養(yǎng)肉湯中，用滅菌脫脂棉塞密封后冷凍保存。需-70℃保存時，接種于含有10%～16%甘油的普通營養(yǎng)肉湯中；需-20℃保存時，接種于含有40%甘油的普通營養(yǎng)肉湯中?？杀４?0d。在制備菌懸液前，先將保存的標(biāo)準(zhǔn)菌種接種于普通營養(yǎng)肉湯中，30℃±1℃培養(yǎng)18h~24h后使用。(規(guī)范性附錄)c)蛋