DB36T-飼料及飼料原料中玉米赤霉烯酮的快速篩查-膠體金快速定量法

ICS?FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)FORMTEXT?????DBFORMTEXT36DBFORMTEXT36/FORMTEXTTXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT飼料及飼料原料中玉米赤霉烯酮的快速篩查膠體金快速定量法FORMTEXTScreeningofzearalenoneinanimalfeedingstuffs——RapidQuantitativeMethodofColloidalGoldTechniqueFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT?????江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局???發(fā)布DBXX/TXXX—XXXX前??言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13原理 14試劑和材料 15儀器和設(shè)備 26試樣制備與保存 27分析步驟 28結(jié)果表述 39重復(fù)性 3附錄A（資料性附錄）膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求 4前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由江西省飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江西省獸藥飼料監(jiān)察所、北京勤邦生物技術(shù)有限公司、拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售（北京）有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊琳芬、符金華、李瑾瑾、魯亞輝、楊春艷、萬宇平、廖豐、劉世寧、賀麗麗。飼料及飼料原料中玉米赤霉烯酮的快速篩查膠體金快速定量法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測(cè)定飼料及飼料原料中玉米赤酶烯酮，為定量篩查方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、小麥、大米、黃豆、豆粕、花生粕、DDGS等原料中及以玉米粉，小麥粉為主要基質(zhì)的飼料成品中玉米赤霉烯酮的快速定量篩查。檢測(cè)限為50μg/kg(ppb)，檢測(cè)范圍為50μg/kg(ppb)-1000μg/kg(ppb)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備原理本方法應(yīng)用了免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，標(biāo)記針對(duì)玉米赤霉烯酮的單克隆抗體，用噴金法固定于硝酸纖維素（NC）膜上，同時(shí)，在硝酸纖維素（NC）膜的顯色區(qū)域有兩個(gè)條帶：質(zhì)控帶和檢測(cè)帶，質(zhì)控條帶上包被有玉米赤霉烯酮抗原，檢測(cè)條帶上包被有抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的二抗。試樣提取液中的玉米赤霉烯酮與檢測(cè)條中膠體金微粒上的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，形成氯金酸-抗體-抗原聚合物，此聚合物和剩余的氯金酸-抗體聚合物在側(cè)流作用下移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)質(zhì)控線時(shí)，質(zhì)控條帶上包被的抗原與剩余的氯金酸-抗體聚合物結(jié)合發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中玉米赤酶烯酮毒素含量負(fù)相關(guān)，而氯金酸-抗體-抗原聚合物繼續(xù)在側(cè)流作用下移動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)條帶后，與檢測(cè)條帶上的二抗形成氯金酸-抗體-抗原&二抗的聚合物，此條帶的顏色同試樣中的玉米赤霉烯酮含量正相關(guān)。由于試樣中的玉米赤酶烯酮的含量一定，質(zhì)控帶的顏色和檢測(cè)帶的顏色此消彼長，呈相關(guān)性。等試驗(yàn)反應(yīng)平衡后，用讀數(shù)儀掃描檢測(cè)條上顯色區(qū)域內(nèi)檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線計(jì)算出試樣中的玉米赤霉烯酮含量。試劑和材料除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定。膠體金免疫層析快速篩查組件（參見附錄A）。玉米赤霉烯酮?dú)埩魴z測(cè)試紙條。樣本稀釋液。甲醇。氫氧化鈉（NaOH1mol/L）：稱取40g氫氧化鈉，加水定容至1000ml，混勻。鹽酸溶液（HCL，1mol/L）：量取83.33mLρ=1.18g/mL的鹽酸，加水定容至1000mL，混勻。70%甲醇：量取70mL甲醇，加入30mL水，混勻。儀器和設(shè)備天平：感量0.01g。渦旋儀。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥3000r/min。微量移液器：20μL～200μL，100μL～1000μL聚苯乙烯離心管：2mL，50mL。讀數(shù)儀：可測(cè)定并顯示膠體金定量檢測(cè)條的測(cè)定結(jié)果。試樣制備與保存試樣制備按GB/T20195要求制備試樣。試樣保存將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。分析步驟試樣提取稱取(5.00±0.01)g飼料樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入10mL70%甲醇（4.5），將瓶塞蓋緊，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液加入600μL樣本稀釋液（4.1.2），混勻，待測(cè)。非谷物基質(zhì)，如果上清液pH值小于6或大于8，非谷物基質(zhì)，如果上清液pH值小于6或大于8，則需要用1mol/L氫氧化鈉溶液（4.3）或1mol/L鹽酸溶液（4.4）調(diào)節(jié)pH至7左右，然后取100μL此溶液加入600μL樣本稀釋液（4.1.2），混勻，待測(cè)不同廠家的玉米赤酶烯酮膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供玉米赤霉烯酮膠體金快速定量檢測(cè)條使用說明，則按照使用說明中規(guī)定的方法進(jìn)行操作。試樣篩查將膠體金檢測(cè)條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至最適試驗(yàn)溫度（23℃-25℃）。將讀數(shù)儀（5.6）打開，按照提示輸入樣品，檢測(cè)人員，檢測(cè)項(xiàng)目，方法等相關(guān)信息。將比色卡平放于桌面，用讀數(shù)儀掃描比色卡上的二維碼，等待檢測(cè)。準(zhǔn)確移取100μL待測(cè)溶液（7.1），加入檢測(cè)條加樣孔中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5分鐘。孵育5min后，用讀數(shù)儀掃描檢測(cè)卡，按下讀取鍵，幾秒鐘讀數(shù)儀的屏幕上即可顯示測(cè)試樣中玉米赤霉烯酮的含量信息?？蛇x擇打印，傳輸，儲(chǔ)存此信息。如結(jié)果顯示：invalid，如果檢測(cè)條上質(zhì)控線（C線）無色，測(cè)試線（T線）上顏色肉眼可見很深，則表明試樣中玉米赤酶烯酮含量非常高，可將試樣提高稀釋倍數(shù)，重新進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表述玉米赤霉烯酮含量以ppb(μg/kg微克每千克）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。重復(fù)性在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測(cè)定方法，并在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一被測(cè)試對(duì)象相互獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過5%。

（資料性附錄）

膠體金免疫層析快速篩查組件試劑配制與技術(shù)要求樣本稀釋液配制（能達(dá)到相當(dāng)效果者均可）磷酸二氫鉀0.2g十二水合磷酸氫二鈉2.9g氯化鈉8.0g氯化鉀0.2g吐溫-200.5mL加水定容至1000mL?；疽蠊ぷ鳝h(huán)境要求氣溫：23℃～25℃?？乖笥衩壮嗝瓜┩肟乖c載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，能夠達(dá)到包被要求?？贵w要求用玉米赤霉烯酮抗原免疫小鼠，制備針對(duì)玉米赤霉烯酮的特異性單克隆抗體，能夠達(dá)到檢測(cè)要求。原材料要求樣品墊：玻璃纖維或無紡布。金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時(shí)間小于10min，釋放效率大于90%。反應(yīng)膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤時(shí)間不小于140s。吸水紙。塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。性能要求準(zhǔn)確度采用200μg/kg（200ppb）、400μg/kg（400ppb）和800μg/kg（800ppb）三個(gè)濃度水平的陽性樣品，每個(gè)濃度水平測(cè)定不低于6次，通過偏差來表達(dá)，3個(gè)濃度水平的6次重復(fù)的偏差均應(yīng)控制在-20%～+20%之間。精密度采用400μg/kg（400ppb）濃度水平的實(shí)際樣品，測(cè)定不低于6次，通過批內(nèi)變異系數(shù)來表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)≤20%。檢測(cè)限計(jì)算20份陰性樣品測(cè)定均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)差，其結(jié)果應(yīng)小于或等于產(chǎn)品靈敏度標(biāo)示值。批間穩(wěn)定性采用400μg/kg（