DB36T-黑斑蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術(shù)規(guī)范編制說(shuō)明

關(guān)于《黑斑蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術(shù)規(guī)范》地方標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源根據(jù)《江西省市場(chǎng)監(jiān)管局關(guān)于下達(dá)2022年第六批江西省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》（贛市監(jiān)標(biāo)函〔2022〕24號(hào)）的任務(wù)安排，江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所等單位承擔(dān)了《黑斑蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術(shù)規(guī)范》地方標(biāo)準(zhǔn)（計(jì)劃編號(hào)：DB36-2022-6-25）的起草工作。（二）起草單位情況江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所南昌大學(xué)江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心（三）主要起草人(以表格形式將內(nèi)容明確)姓名工作單位項(xiàng)目分工劉文舒江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所主要起草者王玉柱江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所主要起草者郭小澤江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所主要起草者李思明江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所主要起草者簡(jiǎn)少卿南昌大學(xué)主要起草者李小勇江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心參與試驗(yàn)陳彥良江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所參與試驗(yàn)唐艷強(qiáng)江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所參與試驗(yàn)肖海紅江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所參與試驗(yàn)制定（修訂）標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義(重要項(xiàng)、需充分說(shuō)明)（一）必要性近年來(lái)，我省黑斑蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，蛙類(lèi)產(chǎn)量居全國(guó)首位。但高密度模式下黑斑蛙免疫力低，各種疾病頻發(fā)且傳播速度快，尤其是類(lèi)似腦膜炎的“歪頭病”。該病傳染性極強(qiáng)，死亡率高，給黑斑蛙的養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)米爾伊麗莎白菌為該病主要病原，米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingiamiricola）是一種革蘭氏陰性菌，2016年以來(lái)，我省多地的養(yǎng)殖黑斑蛙都爆發(fā)了類(lèi)似腦膜炎的“歪頭病”。該病傳染性極強(qiáng)，死亡率高，主要癥狀表現(xiàn)為歪頭、白內(nèi)障、失去定向能力，最終死亡，給黑斑蛙的養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)黑斑蛙“歪頭病”病原為米爾伊麗莎白菌，為黑斑蛙腸道內(nèi)共生的條件致病菌，可以在蛙類(lèi)間廣泛傳播，且耐藥性極強(qiáng)。但是關(guān)于該菌分離、鑒定技術(shù)規(guī)范不足，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，一些養(yǎng)殖戶(hù)亂用藥、亂投醫(yī)，用藥過(guò)量甚至使用違禁藥物的現(xiàn)象，不僅給環(huán)境造成巨大壓力的同時(shí)也引發(fā)了藥物殘留超標(biāo)的食品安全問(wèn)題。因而只有在發(fā)病初期做好該病原菌的分離與鑒定，進(jìn)而進(jìn)行抗生素、中草藥等敏感性分析，才能選擇合適的藥物和合理濃度來(lái)預(yù)防該病的發(fā)生，保障產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。（二）目的與意義本技術(shù)規(guī)范是通過(guò)病原分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)鑒定等手段，可以達(dá)到鑒定米爾伊麗莎白菌的目的。編制該規(guī)范的意義在于提供黑斑蛙養(yǎng)殖中導(dǎo)致“歪頭病”的米爾伊麗莎白菌的分離、鑒定方法，為針對(duì)性藥物的篩選奠定基礎(chǔ)，減少藥物濫用，減低成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量安全。目前，我國(guó)以及江西省還沒(méi)有黑斑蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，亟需出臺(tái)相關(guān)技術(shù)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)予以規(guī)范引導(dǎo)“歪頭病”病原的鑒定與防治。本標(biāo)準(zhǔn)在編制過(guò)程中，盡量直接引用的方式或修改引用相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容，確保與相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相協(xié)調(diào)、相銜接。主要起草過(guò)程(必要項(xiàng))“十三五”期間本團(tuán)隊(duì)承擔(dān)了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題《丘陵地區(qū)梯田生態(tài)立體養(yǎng)殖技術(shù)集成與示范》（2018YFD0901703）、江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳的《江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目》（JXARS-10）、江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃《天然植物提取物在黑斑蛙疾病綠色防控中的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用》、江西省協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目等相關(guān)任務(wù)，涉及到黑斑蛙“歪頭病”病原分離和鑒定等工作。項(xiàng)目組依托上述項(xiàng)目支持，緊密結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題，針對(duì)黑斑蛙病害最為突出的“歪頭病”進(jìn)行病原菌的分離和耐藥性調(diào)查，我們分離鑒定出一株“歪頭病”病原菌米爾伊麗莎白菌JX27（已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），發(fā)現(xiàn)其對(duì)30種抗菌藥物僅有6種敏感，5種中度敏感，19種耐藥。與其他地區(qū)分離的米爾伊麗莎白菌耐藥性結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)耐藥性存在地域差異。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中不根據(jù)藥敏結(jié)果用藥，可能根本不能起到疾病防治的效果。表1不同抗菌藥物對(duì)JX27的抗菌活性抗生素含藥量(μg/片)直徑（mm）敏感程度抗生素含藥量(μg/片)直徑（mm）敏感程度1頭孢他啶

0R16卡那霉素0R2頭孢呋辛

0R17慶大霉素

0R3頭孢拉定

0R18丁胺卡那

0R4頭孢唑啉

0R19頭孢哌酮

17S5頭孢氨芐

0R20頭孢曲松13R6哌拉西林12I21克林霉素

21S7羧芐西林12I22氯霉素

32S8氨芐西林0R23呋喃唑酮0R9苯唑西林

0R24復(fù)方新諾明0R10青霉素

0R25多粘菌素B

0R11紅霉素12I26萬(wàn)古霉素

14I12米諾環(huán)素

23S27環(huán)丙沙星

0R13多西環(huán)素

18S28氧氟沙星

11I14四環(huán)素0R29諾氟沙星

0R15新霉素0R30麥迪霉素

24SS，敏感；I，中度敏感；R，耐藥在永新縣高市鄉(xiāng)合家種養(yǎng)專(zhuān)業(yè)合作社，項(xiàng)目組根據(jù)分離鑒定的米爾伊麗莎白菌及其耐藥性分析，篩選了敏感型藥物并進(jìn)行試驗(yàn)示范，減少了抗生素的濫用，從源頭上減少耐藥菌株的產(chǎn)生，降低耐藥菌株傳播的風(fēng)險(xiǎn)。團(tuán)隊(duì)通過(guò)以上示范推廣確定了本技術(shù)模式核心技術(shù)的穩(wěn)定性，提出制定本標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)建議，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的初稿擬稿。團(tuán)隊(duì)通過(guò)資料查閱、調(diào)研確定了本標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)引用技術(shù)內(nèi)容，同過(guò)與研究技術(shù)成果結(jié)合制定了本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，于2021年1月提出立項(xiàng)建議，報(bào)送江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳安監(jiān)局，由江西省質(zhì)監(jiān)局標(biāo)準(zhǔn)化處把《黑斑蛙米爾伊麗莎白菌分離鑒定技術(shù)規(guī)范》列入2022年度第六批江西省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃。為進(jìn)一步提升本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和規(guī)范性，起草小組征求了5位行業(yè)專(zhuān)家意見(jiàn)，根據(jù)專(zhuān)家提出的修改意見(jiàn)，對(duì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容進(jìn)行了完善和補(bǔ)充，形成征求意見(jiàn)稿，報(bào)送江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳安監(jiān)局。制定（修訂）標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系(必要項(xiàng))1.與有關(guān)法律法規(guī)一致，并與現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)相協(xié)調(diào)，同時(shí)符合我國(guó)國(guó)情和我省特點(diǎn)。2.編寫(xiě)格式符合GB/T1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》的要求。3.本標(biāo)準(zhǔn)涉及內(nèi)容符合以下現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求：GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求《動(dòng)物病原微生物菌（毒）種保藏管理辦法》《中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例》4.本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行農(nóng)業(yè)有關(guān)法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)不違背或不沖突。5.在充分考慮了標(biāo)準(zhǔn)須具有包容性、先進(jìn)性、實(shí)用性和可操作性的原則上，以前期研究結(jié)果和關(guān)鍵技術(shù)熟化應(yīng)用為依據(jù)，編制了《稻蛙綜合種養(yǎng)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》。6.本標(biāo)準(zhǔn)提出8大條涵蓋了設(shè)備和材料、術(shù)語(yǔ)和定義、培養(yǎng)基和試劑、分離和鑒定程序、操作步驟、菌種保存及生物安全措施等技術(shù)要點(diǎn)，是在邊試驗(yàn)邊總結(jié)的過(guò)程中完成的，已在生產(chǎn)實(shí)際中得到檢驗(yàn)，科學(xué)、規(guī)范、可操作性強(qiáng)，對(duì)江西省黑斑蛙米爾伊麗莎白菌的分離鑒定具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義，對(duì)促進(jìn)我省黑斑蛙“歪頭病”的防治具有重要意義。主要條款的說(shuō)明(重要項(xiàng))1培養(yǎng)基和試劑除特殊說(shuō)明，所有實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水1.1營(yíng)養(yǎng)肉湯（附錄）1.2非選擇性細(xì)菌培養(yǎng)基（附錄）1.3DNAMarker：1Kb1.4擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及引物16SrDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：約1500bp上游引物序列：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′下游引物序列：1492r5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′gyrB擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：約1200bp上游引物序列：gyrB3F5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′下游引物序列：gyrB14R5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′1.5滅菌生理鹽水:0.6%1.610×PCR緩沖液1.7Taq聚合酶（0.5U/μL）1.8dNTPs（2mmol）1.91.2%瓊脂糖凝膠（附錄）1.1050×TAE緩沖溶液（附錄）1.111×TAE緩沖溶液（電泳緩沖液）（附錄）1.12核酸染料：GelRed2操作步驟2.1采樣①病蛙采集回實(shí)驗(yàn)室后，用清水清洗蛙體，置無(wú)菌操作臺(tái)紫外線滅菌待用；②將病蛙置于冰水混合物中低溫麻醉或?qū)Σ⊥苓M(jìn)行毀髓法操作；③待病蛙完全進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，取出病蛙，用吸水紙吸去體表水分；④用酒精棉球（75%消毒酒精）對(duì)病蛙體表和眼部消毒；⑤將殺菌消毒后的病蛙置于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)的托盤(pán)上，選取眼部病變明顯處，用鑷子和手術(shù)剪刀進(jìn)行采樣。2.2病菌的培養(yǎng)①在無(wú)菌狀態(tài)下將所采病變組織進(jìn)行剪碎或勻漿；②將剪碎或勻漿后的組織液與營(yíng)養(yǎng)肉湯按照1:10比例進(jìn)行混合，恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃）培養(yǎng)24h，觀察；③將培養(yǎng)好的菌懸濁液搖晃均勻，在無(wú)菌狀態(tài)下劃線接種于無(wú)菌非選擇性培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃）培養(yǎng)24h，觀察；④選取可疑菌落接種于新的無(wú)菌非選擇性培養(yǎng)基中，溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃）培養(yǎng)24h，待進(jìn)一步鑒定。2.3病菌樣品的鑒定2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定菌落顏色為米色或淡黃色，邊緣整齊，半透明，表面濕潤(rùn)、光滑。2.3.2分子生物學(xué)鑒定2.3.2.1PCR模板的制備接種環(huán)挑選培養(yǎng)基上待檢菌的單獨(dú)菌落，置于0.5ml滅菌生理鹽水中，4000r/min離心2min，棄上清。再加0.5mL無(wú)菌水重懸并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰面上，冷卻后4000r/min離心30s，取上清液作為PCR模板待用。2.3.2.2PCR反應(yīng)體系的配制根據(jù)PCR試劑用量，配制PCR反應(yīng)體系。2.3.2.3PCR反應(yīng)條件16SrRNA擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸90s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。gyrB擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。2.3.2.4電泳及成像觀察取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1μL上樣緩沖液，混勻后加入1.2%瓊脂糖凝膠電泳加樣孔中，同時(shí)在空白孔加入Marker標(biāo)準(zhǔn)品。電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外投射儀上，打開(kāi)紫外燈觀察或用凝膠成像儀進(jìn)行成像觀察，確定PCR效果。2.3.2.5基因序列測(cè)序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測(cè)定，在NCBI對(duì)比，與已有基因同源性高于98%即可確定為米爾伊麗莎白菌。3菌種保存及生物安全為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人員進(jìn)行檢測(cè)，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)參照GB/T19489及國(guó)家有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。菌種應(yīng)由具備專(zhuān)業(yè)相關(guān)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《動(dòng)物病原微生物菌（毒）種保藏管理辦法》《中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例》進(jìn)行妥善保存。重大意見(jiàn)分歧的處理依據(jù)和結(jié)果(必要項(xiàng))該標(biāo)準(zhǔn)是在近三年的試驗(yàn)與實(shí)踐總結(jié)的基礎(chǔ)上總結(jié)形成的，在標(biāo)準(zhǔn)撰寫(xiě)過(guò)程中，沒(méi)有出現(xiàn)重大意見(jiàn)分歧，在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施過(guò)程中，有待于廣泛征求廣大科研、生產(chǎn)、管理等單位的意見(jiàn)，依據(jù)我國(guó)我省實(shí)際情況，按照標(biāo)準(zhǔn)化的原則，協(xié)商解決分歧意見(jiàn)