畜禽肉中食源性興奮劑和孕激素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 編制說(shuō)明

畜禽肉中食源性興奮劑和孕激素的測(cè)定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

編制說(shuō)明

1

目錄

1工作簡(jiǎn)況........................................................................................................4

1.1標(biāo)準(zhǔn)制定的任務(wù)來(lái)源......................................................................................4

1.2主要工作過(guò)程..................................................................................................4

1.3標(biāo)準(zhǔn)起草單位和編制組成員..........................................................................4

2標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性和預(yù)期效果....................................................................5

2.1標(biāo)準(zhǔn)編制的必要性..........................................................................................5

2.2標(biāo)準(zhǔn)編制的預(yù)期效果......................................................................................7

3標(biāo)準(zhǔn)制定的原則和依據(jù)................................................................................7

4主要技術(shù)內(nèi)容的論據(jù)....................................................................................7

5主要內(nèi)容和主要試驗(yàn)....................................................................................7

5.1試驗(yàn)試劑與材料..............................................................................................8

5.1.1目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)...............................................................8

5.1.2主要試劑.............................................................................................10

5.2儀器與設(shè)備....................................................................................................10

5.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制............................................................................................11

5.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制.............................................................................11

5.3.2混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制.....................................................................11

5.3.3外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制.............................................................12

5.3.4內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制.............................................................12

5.3.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制.........................................................................12

5.4試驗(yàn)樣品的處理............................................................................................12

5.4.1提取.....................................................................................................12

5.4.2凈化.....................................................................................................13

5.4.3空白試驗(yàn).............................................................................................13

5.4.4基質(zhì)空白提取液.................................................................................13

2

5.5儀器分析條件................................................................................................13

5.5.1液相色譜條件.....................................................................................13

5.5.2質(zhì)譜條件.............................................................................................13

5.6結(jié)果與結(jié)論...................................................................................................15

5.6.1儀器條件選擇....................................................................................15

5.6.2提取溶劑的選擇.................................................................................21

5.6.3提取溶劑酸度的考察.........................................................................21

5.6.4凈化劑的選擇....................................................................................22

5.6.5復(fù)溶溶劑的選擇................................................................................23

5.6.6對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的選擇............................................................................23

5.6.7基質(zhì)效應(yīng)的考察................................................................................23

5.6.8方法線性與靈敏度............................................................................24

5.6.9方法準(zhǔn)確度和精密度........................................................................24

5.6.10與國(guó)標(biāo)方法比對(duì)...............................................................................34

5.7實(shí)際樣品的測(cè)定............................................................................................35

5.8實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果........................................................................................36

6采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的程度與水平的簡(jiǎn)要說(shuō)明...................................................49

7標(biāo)準(zhǔn)涉及的專利及相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)說(shuō)明.......................................................49

8重大意見(jiàn)分歧的處理經(jīng)過(guò)和依據(jù)...............................................................49

9與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系.......................................................49

參考文獻(xiàn)..........................................................................................................51

3

1工作簡(jiǎn)況

1.1標(biāo)準(zhǔn)制定的任務(wù)來(lái)源

為保障冬奧食品安全，特別是對(duì)畜禽肉供應(yīng)保障提供技術(shù)支撐,北京市科學(xué)技術(shù)

研究院分析測(cè)試研究所（北京市理化分析測(cè)試中心）（原北京市理化分析測(cè)試中心，

以下簡(jiǎn)稱“分析測(cè)試所”）申報(bào)的北京市市級(jí)財(cái)政項(xiàng)目《創(chuàng)新工程-預(yù)研究-冬奧食品安

全檢測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備及在食品供應(yīng)基地保障中的應(yīng)用》（項(xiàng)目編號(hào)：

PXM2020_178305_000007）獲得立項(xiàng)批復(fù)，項(xiàng)目執(zhí)行期為2020年1月到2020年12月。

1.2主要工作過(guò)程

2023年2月立項(xiàng)申請(qǐng)書(shū)提交至北京預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)；3月27日，參加了北京預(yù)防醫(yī)

學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)論證會(huì)，學(xué)術(shù)委員會(huì)專家聽(tīng)取了立項(xiàng)報(bào)告，審閱了相關(guān)申報(bào)材料，

經(jīng)質(zhì)詢和討論，學(xué)術(shù)委員會(huì)建議將立項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)名稱改為“畜禽肉中食源性興奮劑和孕激

素檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”，并一致同意通過(guò)了該課題的立項(xiàng)評(píng)審。本項(xiàng)目按照

以下技術(shù)路線開(kāi)展工作，見(jiàn)圖1。

2020年1月至2021年5月，課題組經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究，完成了“畜禽肉中食源性

興奮劑和孕激素檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”的方法開(kāi)發(fā)，2023年6月到8月，組織了2

家食品檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了數(shù)據(jù)的匯總和分析整理

工作，并編寫(xiě)完成了本項(xiàng)目的技術(shù)報(bào)告和團(tuán)標(biāo)草案。

1.3標(biāo)準(zhǔn)起草單位和編制組成員

本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)由分析測(cè)試所項(xiàng)目研究團(tuán)隊(duì)起草，起草人馮月超（副研究員）、劉艷

（研究員）、王建鳳（高級(jí)工程師），編制組成員還包括北京市疾病預(yù)防控制中心的

郭巧珍（副研究員）、姚凱（助理研究員）、張晶（研究員），北京市延慶區(qū)疾病預(yù)

防控制中心林強(qiáng)（副研究員）、李晶晶（副主任技師）、蘇東霞（副主任技師。）

4

圖1技術(shù)路線圖

2標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性和預(yù)期效果

2.1標(biāo)準(zhǔn)編制的必要性

食源性興奮劑是指來(lái)源于食品中的興奮劑，包括一般性食品及保健食品中從生產(chǎn)

到加工過(guò)程中天然存在或故意添加而殘留的興奮劑成分。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）

發(fā)布的《2021年禁用清單》中明確規(guī)定β2-激動(dòng)劑、蛋白同化制劑、糖皮質(zhì)激素類、

利尿劑等興奮劑為運(yùn)動(dòng)員禁、限用物質(zhì)。由于食物種類非常多，而且從農(nóng)田到餐桌供

5

應(yīng)鏈條長(zhǎng)，食源性興奮劑的防范難度較大，運(yùn)動(dòng)員因食物導(dǎo)致的興奮劑陽(yáng)性案例在體

育賽事中屢見(jiàn)不鮮。孕激素如孕酮等是食品中天然存在的激素，一些合成類孕激素已

經(jīng)被我國(guó)明令禁止，《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公

告第250號(hào)）》（2019年12月）中規(guī)定禁止使用醋酸美侖孕酮。為了保障大型體育

賽事的成功舉辦，防止違禁物質(zhì)污染食物，評(píng)估食品中食源性興奮劑等激素的風(fēng)險(xiǎn)，

建立高通量、快速、準(zhǔn)確的食源性興奮劑等激素的檢測(cè)方法非常有必要。

食源性興奮劑等激素物質(zhì)檢測(cè)方法主要有色譜-質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法、生物芯片

等技術(shù)，目前色譜-質(zhì)譜因?yàn)槠錅?zhǔn)確度高、靈敏度高、檢測(cè)通量高等優(yōu)勢(shì)是食源性興

奮劑等激素的主要檢測(cè)手段。然而食源性興奮劑檢測(cè)依然面臨較大挑戰(zhàn)，主要有以

下幾點(diǎn)：（1）同類物質(zhì)極性差異太大，采用同一種檢測(cè)方法難以獲得較好的回收率。

如：比如苯丙酸諾龍的極性較弱，導(dǎo)致樣品處理中因?yàn)槊撝^(guò)程而有較大損失。（2）

食源性興奮劑檢出限要求低，通常為痕量甚至是超痕量，且食品基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)

顯著，樣品前處理步驟繁瑣。目前傳統(tǒng)的固相萃取和溶劑萃取等前處理過(guò)程復(fù)雜，使

檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法體現(xiàn)該儀器的優(yōu)勢(shì)，近年發(fā)展的濾過(guò)型凈化柱法則存在成本高的

問(wèn)題。QuEChERS方法在食源性興奮劑和孕激素檢測(cè)的研究，多數(shù)是僅針對(duì)單一種類

的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，畜禽肉中高通量多殘留同時(shí)檢測(cè)的研究較少。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，目前關(guān)

于畜禽肉中興奮劑和孕激素檢測(cè)方法的相關(guān)現(xiàn)行有效國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要有以下7個(gè)：

（1）GB/T21981-2008動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

（2）農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008動(dòng)物源性食品中11種激素殘留檢測(cè)液相色譜-串

聯(lián)質(zhì)譜法

（3）SN/T1980-2007進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中孕激素類藥物殘留量的檢測(cè)方法高

效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

（4）農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測(cè)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

（5）SN/T4744-2017進(jìn)出口食用動(dòng)物性激素殘留量的測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜

法

（6）GB31658.25-2022食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中10種利尿藥殘留量的測(cè)

定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

（7）GB31658.22-2022食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的

6

測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

其中，農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008只檢測(cè)了孕激素和蛋白同化激素共11種，GB/T

21981-2008規(guī)定了動(dòng)物源食品中50種激素的測(cè)定方法，但該方法過(guò)程繁瑣，需要將樣

品過(guò)兩種凈化柱，耗時(shí)較長(zhǎng)，需要18種內(nèi)標(biāo)物，檢測(cè)成本較高。其他5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是只針

對(duì)某一類別進(jìn)行檢測(cè)，覆蓋范圍窄，因此亟待開(kāi)發(fā)一種高通量食源性興奮劑檢測(cè)方法。

2.2標(biāo)準(zhǔn)編制的預(yù)期效果

本項(xiàng)目在充分調(diào)研畜牧生產(chǎn)用藥基礎(chǔ)上，結(jié)合WADA的《禁用清單國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)》，

以及國(guó)內(nèi)相關(guān)法規(guī)，以β2-興奮劑、β-阻斷劑、利尿劑、蛋白同化激素、糖皮質(zhì)激素、

孕激素共六大類化合物為研究對(duì)象，結(jié)合QuEChERS樣品前處理技術(shù)，完成了《畜

禽肉中食源性興奮劑和孕激素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案征，該方

法前處理簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢出限能夠滿足我國(guó)法規(guī)的限量要求，一次檢測(cè)能夠

同時(shí)測(cè)定45個(gè)化合物，實(shí)現(xiàn)了高通量和高效率，該標(biāo)準(zhǔn)方法能夠?yàn)榇笮腕w育賽事運(yùn)

動(dòng)員的肉類食品安全檢測(cè)的技術(shù)支持，彌補(bǔ)現(xiàn)有國(guó)標(biāo)的不足。

3標(biāo)準(zhǔn)制定的原則和依據(jù)

在實(shí)施過(guò)程中，本項(xiàng)目組按照《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》（GB/T

27404-2008）對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察，并選擇食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。兼顧

國(guó)內(nèi)監(jiān)測(cè)分析實(shí)際情況，確保本標(biāo)準(zhǔn)的先進(jìn)性、可操作性和實(shí)用性。

（1）先進(jìn)性：其準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度達(dá)到國(guó)外同類方法的同等水平。

（2）可操作性：符合我國(guó)目前檢測(cè)儀器設(shè)備和試劑、材料的供應(yīng)條件。

（3）實(shí)用性：符合檢測(cè)從業(yè)人員的技術(shù)水平，能被國(guó)內(nèi)分析實(shí)驗(yàn)室所使用并達(dá)

到所規(guī)定的要求。

4主要技術(shù)內(nèi)容的論據(jù)

無(wú)

5主要內(nèi)容和主要試驗(yàn)

7

5.1試驗(yàn)試劑與材料

5.1.1目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

45種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品和9種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品名稱、純度或者含量、CAS號(hào)、

具體供應(yīng)來(lái)源見(jiàn)表1。

表1被測(cè)化合物及對(duì)應(yīng)9種內(nèi)標(biāo)的名稱、CAS號(hào)、供應(yīng)來(lái)源、純度/濃度

序號(hào)目標(biāo)化合物英文名稱CAS供應(yīng)商純度/濃度

1.克倫特羅Clenbuterol21898-19-1Dr.Ehrenstorfer99.3%

TorontoResearch

2.妥布特羅Tulobuterol41570-61-097.0%

Chemicals

3.班布特羅Bambuterol81732-46-9Dr.Ehrenstorfer98.6%

4.克倫丙羅Clenproperol38339-11-6Dr.Ehrenstorfer98.0%

WITEGALaboratorien

5.噴布特羅Penbuterol28163-36-299.7%

Berlin-AdlershofGmbH

WITEGALaboratorien

6.克倫塞羅Clencyclohexerol1435934-75-099.8%

Berlin-AdlershofGmbH

7.馬布特羅Mabuterol54240-36-7Dr.Ehrenstorfer90.6%

WITEGALaboratorien

8.溴布特羅Brombuterol41937-02-499.5%

Berlin-AdlershofGmbH

TorontoResearch

9.西馬特羅Cimaterol54239-37-198.0%

Chemicals

10.氯丙那林Clorprenaline6933-90-0Dr.Ehrenstorfer98.0%

11.奧西那林Metaproterenol5874-97-5Dr.Ehrenstorfer99.2%

12.沙丁胺醇Salbutamol18559-94-9Dr.Ehrenstorfer99.9%

WITEGALaboratorien

13.齊帕特羅Zilpaterol119520-06-899.6%

Berlin-AdlershofGmbH

StanfordAnalytical

14.萊克多巴胺Ractopamine90274-24-195.8%

ChemicalsInc.

15.沙美特羅Salmeterol89365-50-4Dr.Ehrenstorfe99.4%

16.阿替洛爾Atenolol29122-68-7Dr.Ehrenstorfer99.0%

17.普萘洛爾Propranolol318-98-9Dr.Ehrenstorfer99.6%

18.美托洛爾Metoprolol56392-17-7Dr.Ehrenstorfer98.0%

8

TorontoResearch

19.氨苯喋啶Triamterene396-01-098.0%

Chemicals

StanfordAnalytical

20.螺內(nèi)酯Spironolactone1952-1-799.5%

ChemicalsInc.

TorontoResearch

21.坎利酮Canrenone976-71-698.0%

Chemicals

22.睪酮Testosterone58-22-0Dr.Ehrenstorfer99.3%

23.諾龍Nortestosterone434-22-0Dr.Ehrenstorfer96.7%

StanfordAnalytical

24.去氫甲睪酮Methandienone72-63-999.3%

ChemicalsInc.

25.勃地酮Boldenone846-48-0Dr.Ehrenstorfer98.8%

26.群勃龍Trenbolone10161-33-8Dr.Ehrenstorfer96.3%

TorontoResearch

27.雄烯二酮4-Androstene-363-5-899.7%

Chemicals

28.脫氫表雄酮Prasterone53-43-0Dr.Ehrenstorfer99.3%

29.甲基睪酮Methyltestosterone58-18-4Dr.Ehrenstorfer97.7%

30.美睪酮Mesterolone1424-00-6AChemtekInc.99.0%

31.美雄諾龍Mestanolone521-11-9Dr.Ehrenstorfer97.8%

32.司坦唑醇Stanozolol10418-03-8Dr.Ehrenstorfer99.9%

33.地塞米松Dexamethasone50-02-2Dr.Ehrenstorfer99.2%

34.氫化可的松Hydrocortisone50-23-7Dr.Ehrenstorfer99.3%

35.波尼松龍Prednisolone50-24-8Dr.Ehrenstorfer99.8%

36.可的松Cortisone53-06-5Dr.Ehrenstorfer99.1%

37.波尼松Prednisone53-03-2Dr.Ehrenstorfer99.8%

FluocinoloneTorontoResearch

38.醋酸氟輕松67-73-298.0%

AcetonideChemicals

TorontoResearch

39.氟氫可的松Fludrocortison127-31-199.3%

Chemicals

TorontoResearch

40.倍氯米松Beclomethasone4419-39-099.3%

Chemicals

9

41.孕酮Progesterone57-83-0Dr.Ehrenstorfer99.7%

42.醋酸美倫孕酮Melengestrolacetate2919-66-6Dr.Ehrenstorfer99.0%

Medroxyprogesterone

43.醋酸甲羥孕酮71-58-9Dr.Ehrenstorfer99.2%

acetate

17α-Hydroxyprogester

44.17α-羥孕酮604-09-1Dr.Ehrenstorfer99.2%

one

45.甲地孕酮Megestrol3562-63-8Dr.Ehrenstorfer99.4%

StanfordAnalytical

I-1克倫特羅-D9Clenbuterol-D9129138-58-599.7%

ChemicalsInc.

I-2萊克多巴胺-D5Ractopamine-D590274-24-1AChemtekInc.95.0%

I-3沙丁胺醇-D3Salbutamol-D31219798-60-3AChemtekInc.98.5%

I-4去甲烏藥堿-D4Methyltestosterone-D32249814-83-1FirstStandard100μg/mL

TorontoResearch

I-5睪酮-D3Testosterone-D377546-39-5100μg/mL

Chemicals

I-6勃地酮-D3Boldenone-D3361432-76-0AChemtekInc.99.2%

TorontoResearch

I-7孕酮-D9Progesterone-D915775-74-395.0%

Chemicals

I-8氫化可的松-D3Hydrocortisone-D3115699-92-8AChemtekInc.10μg/mL

TorontoResearch

I-9地塞米松-D5Dexamethasone-D5358731-91-698.0%

Chemicals

5.1.2主要試劑

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（優(yōu)級(jí)純）、乙酸（優(yōu)級(jí)純）均購(gòu)于美

國(guó)FisherScientific有限公司。無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、中性氧化鋁（100-200目）購(gòu)自

國(guó)藥集團(tuán)試劑公司；N-丙基乙二胺鍵合固相吸附材料（PSA，40-60μm）、十八烷基

鍵合硅膠吸附材料（C18，40-60μm）、氨基吸附劑（NH2，40-60μm）均購(gòu)于博納艾

杰爾有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水由Milli-Q超純水凈化處理系統(tǒng)制備。

5.2儀器與設(shè)備

ACQUITYUPLC超高效液相色譜儀、XevoTQ-S四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)

10

WATERS；高速冷凍離心機(jī)：GR22GIII，日本HITACHI；氮吹儀：N-EVAPTM112，

配備OA-SYSTM水浴加熱裝置，美國(guó)Organomation；多管渦旋混勻儀：MS200，杭州

瑞誠(chéng)儀器有限公司；渦旋混合器：vortex-genie2，美國(guó)scientificindustries；數(shù)控超聲

波清洗器：KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司；純水儀：Milli-QIntegral5，德國(guó)

默克公司。

5.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

5.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量（相當(dāng)于活性成分10mg），用甲醇溶解并定容于10mL，

配置成濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

5.3.2混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

依據(jù)化合物的類別將被測(cè)物分成7組，用甲醇配置成7個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)

儀器的響應(yīng)值，確定混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各物質(zhì)的濃度，具體見(jiàn)表3。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均

在-20℃冷凍避光儲(chǔ)存。

表2目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和中間液的分組和濃度

儲(chǔ)備液中間液儲(chǔ)備液中間液

序

化合物濃度濃度組別序號(hào)化合物濃度濃度組別

號(hào)

(μg/mL)(μg/mL)(μg/mL)(μg/mL)

1克倫特羅1100組128脫氫表雄酮2200組4

2妥布特羅1100組129甲基睪酮2200組4

3班布特羅1100組130美睪酮8200組4

4克倫丙羅2200組131美雄諾龍2200組4

5噴布特羅1100組132司坦唑醇2200組4

6克倫塞羅1100組133地塞米松4400組3

7馬布特羅2200組134氫化可的松4400組5

8溴布特羅1100組135波尼松龍4400組5

9西馬特羅2200組136可的松4400組5

10氯丙那林1100組137波尼松4400組5

11奧西那林1100組138醋酸氟輕松4400組5

12沙丁胺醇1100組139氟氫可的松4400組5

13齊帕特羅1100組140倍氯米松4400組5

14萊克多巴胺1100組141孕酮2200組6

11

儲(chǔ)備液中間液儲(chǔ)備液中間液

序

化合物濃度濃度組別序號(hào)化合物濃度濃度組別

號(hào)

(μg/mL)(μg/mL)(μg/mL)(μg/mL)

15沙美特羅1100組142醋酸美倫孕酮2200組6

16阿替洛爾1100組243醋酸甲羥孕酮2200組6

17普萘洛爾1100組24417α-羥孕酮2200組6

18美托洛爾1100組245甲地孕酮2200組6

19氨苯喋啶2200組3I-1克倫特羅-D91100組7

萊克多巴胺-

20螺內(nèi)酯2200組3I-21100組7

D5

21坎利酮2200組3I-3沙丁胺醇-D31100組7

22睪酮2200組4I-4甲基睪酮-D32200組7

23諾龍2200組4I-5睪酮-D32200組7

24去氫甲睪酮2200組4I-6勃地酮-D32200組7

25勃地酮2200組4I-7孕酮-D92200組7

氫化可的松

26群勃龍2200組4I-84400組7

-D3

27雄烯二酮2200組4I-9地塞米松-D54400組7

5.3.3外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

臨用前分別取上述1-6組混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，配

置成外標(biāo)混合中間液。

5.3.4內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制

取組7混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，用甲醇定容于10mL，配置成內(nèi)標(biāo)混合中間液。

5.3.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

移取一定量外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用基質(zhì)空白提取液逐級(jí)稀釋，并向其中添加等量

的內(nèi)標(biāo)中間液工作液。

5.4試驗(yàn)樣品的處理

5.4.1提取

以雞肉為基質(zhì)，準(zhǔn)確稱取粉碎均質(zhì)后的雞肉樣品5.0g于50mL螺蓋離心管中，

加入40μL內(nèi)標(biāo)混合中間液，加入5mL超純水，渦旋10s后，準(zhǔn)確加入20mL含0.5%

乙酸的乙腈溶液，振蕩提取15min，加入1.0g氯化鈉和4.0g無(wú)水硫酸鎂，快速混勻，

12

繼續(xù)振蕩10min，8000r/min離心5min。

5.4.2凈化

移取上清液10mL于另一事先裝入PSA165mg、C18165mg、中性氧化鋁165

mg、900mg無(wú)水硫酸鎂的螺蓋離心管中，振蕩混勻10min，8000r/min離心5min。

準(zhǔn)確移取上清液5mL，置于氮吹儀上45℃吹干，加入1.0mL甲醇/水（含0.1%甲

酸和5mmol/L乙酸銨）1/9（v/v），渦旋復(fù)溶，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，待上機(jī)測(cè)

定。

5.4.3空白試驗(yàn)

不稱取試樣，按上述步驟做空白實(shí)驗(yàn)。

5.4.4基質(zhì)空白提取液

稱取不含被測(cè)物的陰性雞肉樣品5.0g，不加內(nèi)標(biāo)，按照上述方法進(jìn)行前處理，

得到空白基質(zhì)提取液，用于配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

5.5儀器分析條件

5.5.1液相色譜條件

色譜柱：WatersAcquityBEHC18反相液相色譜柱（2.1mm×10mm,1.7μm）；柱

溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液，B甲醇，梯度洗脫見(jiàn)表3。

表3HPLC梯度洗脫條件

時(shí)間（min）A（%）B（%）流速（mL/min）

09550.3

0.59550.3

1.090100.3

6.030700.3

8.020800.3

9.001000.3

10.001000.3

10.19550.3

12.09550.3

5.5.2質(zhì)譜條件

電離源：電噴霧正離子模式（ESI+）；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛

13

細(xì)管電壓：0.5kV；錐孔電壓：30V；脫溶劑氣流速度：650L/h；脫溶劑氣溫度：450℃；

錐孔氣流速：150L/h。其它主要參數(shù)等見(jiàn)表4。

表4目標(biāo)分析物及9種內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)

保留時(shí)間母離子定量離子（m/z）定性離子（m/z）碎裂電壓

編號(hào)目標(biāo)化合物

(min)(m/z)（碰撞能）（碰撞能）(V)

1.克倫特羅4.56277.4132.1(26)203.1(14)34

2.妥布特羅4.97228.4172.2(10)154.1(16)18

3.班布特羅5.12368.772.2(34)294.4(20)18

4.克倫丙羅2.83263.3203.1(16)168.1(26)26

5.噴布特羅7.31292.5236.3(14)74.2(20)72

6.克倫塞羅3.81319.4203.1(20)81.1(26)36

7.馬布特羅5.02311.4217.2(24)237.2(14)20

8.溴布特羅4.96367.4132.3(46)293.1(18)26

9.西馬特羅2.64220.4160.2(14)143.2(24)18

10.氯丙那林4.51214.3154.2(16)118.9(26)18

11.奧西那林2.20212.3152.1(16)125.2(20)22

12.沙丁胺醇2.86240.4148.2(16)166.2(12)16

13.齊帕特羅2.82262.4185.2(24)202.2(18)18

14.萊克多巴胺4.21302.5107.2(26)164.2(14)26

15.沙美特羅7.31416.791.2(38)380.6(18)25

16.阿替洛爾2.87267.4145.2(26)74.2(22)20

17.普萘洛爾5.94260.4183.2(18)116.2(16)18

18.美托洛爾4.75268.572.1(18)116.2(18)18

19.氨苯喋啶4.43254.4141.1(44)104.2(38)16

20.螺內(nèi)酯7.10341.5107.2(26)91.1(48)48

21.坎利酮7.11341.5107.2(28)91.1(52)58

22.睪酮7.49289.597.1(20)109.2(22)48

23.諾龍7.20275.5109.2(28)239.3(16)2

24.去氫甲睪酮7.31301.5121.1(26)149.2(14)26

25.勃地酮7.06287.5121.1(26)135.2(14)30

26.群勃龍6.98271.4199.2(22)165.3(44)62

27.雄烯二酮7.19287.597.2(20)109.2(24)34

14

保留時(shí)間母離子定量離子（m/z）定性離子（m/z）碎裂電壓

編號(hào)目標(biāo)化合物

(min)(m/z)（碰撞能）（碰撞能）(V)

28.脫氫表雄酮7.49289.5253.3(10)213.3(18)6

29.甲基睪酮7.75303.697.1(26)109.2(24)32

30.美睪酮8.33305.5269.4(16)95.6(32)15

31.美雄諾龍8.45305.6269.4(14)105.2(20)10

32.司坦唑醇8.33329.681.1(38)95.1(38)16

33.地塞米松6.78393.5373.4(8)355.3(10)12

34.氫化可的松6.42363.5121.1(22)105.1(44)44

35.波尼松龍6.42361.5325.4(8)307.4(10)24

36.可的松6.19361.6163.2(24)121.2(36)18

37.波尼松6.11359.5147.1(26)313.4(12)28

38.醋酸氟輕松6.82453.5121.2(28)433.4(8)16

39.氟氫可的松6.34381.5239.3(24)91.2(58)38

40.倍氯米松6.81409.5373.4(8)121.2(42)6

41.孕酮8.40315.597.1(20)109.2(22)12

42.醋酸美倫孕酮8.30397.2279.2(22)337.1(14)2

43.醋酸甲羥孕酮8.25387.2123.0(32)327.2(14)2

44.17α-羥孕酮7.58331.297.0(26)109.2(30)4

45.甲地孕酮7.87343.1187.1(26)325.1(18)2

I-1克倫特羅-D94.54286.4204.1(16)133.0(28)6

I-2萊克多巴胺-D54.19307.5165.2(14)111.1(32)14

I-3沙丁胺醇-D32.85243.5151.2(16)169.2(12)32

I-4去甲烏藥堿-D43.28276.5108.3（20）