高中生物2015-2024年10年高考真題專題分類匯編-專題22基因工程考點2dna的粗提取與鑒定、pcr擴增與電泳鑒定

第第頁專題22基因工程考點2DNA的粗提取與鑒定、PCR擴增與電泳鑒定(2024山東，13，2分)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是()A.整個提取過程中可以不使用離心機B.研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中C.鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發(fā)生改變D.僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾【答案】ADNA的提取過程中可以不使用離心機，可將研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，直接取上清液放入燒杯中，A正確，B錯誤；鑒定過程需要沸水浴加熱，DNA分子在高溫下會解螺旋，雙螺旋結構會發(fā)生改變，C錯誤；加熱是唯一變量，設置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。(2024黑、吉、遼，7，2分)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗，下列敘述正確的是()A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C.在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來【答案】A瓊脂糖凝膠濃度太高會影響DNA片段的遷移，濃度太低則會導致分辨率降低，因此瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小，A正確；凝膠載樣緩沖液中的指示劑可避免DNA分子遷移出凝膠，起到指示電泳進程的作用，不能指示DNA分子的具體位置，B錯誤；DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在同一電場作用下，DNA片段不一定向負極遷移，一般情況下，DNA片段越長移動速率越慢，C錯誤；凝膠中的DNA分子通過染色后，可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。(2024廣東，4，2分)關于技術進步與科學發(fā)現(xiàn)之間的促進關系，下列敘述正確的是()A.差速離心法的應用促進對細胞器的認識B.電子顯微鏡的發(fā)明促進細胞學說的提出C.光合作用的解析促進花期控制技術的成熟D.RNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)促進PCR技術的發(fā)明【答案】A利用差速離心法可分離出不同細胞器，促進了對細胞器的認識，A正確；光學顯微鏡的發(fā)明促進細胞學說的提出，B錯誤；人工控制花期的主要途徑有溫度處理(通過調控溫度促進或抑制花芽發(fā)育等)、光照處理(控制光照時間長短)、植物生長調節(jié)劑處理及栽培措施處理等，花期控制與光合作用的解析無關，C錯誤；耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)促進PCR技術的成熟，D錯誤。(2024河北，13，2分)下列相關實驗操作正確的是()A.配制PCR反應體系時，加入等量的4種核糖核苷酸溶液作為擴增原料B.利用添加核酸染料的凝膠對PCR產物進行電泳后，在紫外燈下觀察結果C.將配制的酵母培養(yǎng)基煮沸并冷卻后，在酒精燈火焰旁倒平板D.將接種環(huán)燒紅，迅速蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落【答案】BPCR利用了DNA復制的原理，DNA的單體是脫氧核糖核苷酸，配制PCR反應體系時，擴增原料不能為4種核糖核苷酸，A錯誤；瓊脂糖凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結合，凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，B正確；將配制的酵母培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌法滅菌并冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰旁倒平板，C錯誤；將接種環(huán)燒紅，待冷卻后(避免菌種被燙死)，迅速蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，D錯誤。(2024湖南，15，4分)（不定項）最早的雙脫氧測序法是在PCR反應體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則，以加入ddATP的體系為例:若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列，結果如圖所示。下列敘述正確的是()A.上述PCR反應體系中只加入一種引物B.電泳時產物的片段越小，遷移速率越慢C.5'-CTACCCGTGAT-3'，為對照個體的一段序列D.患者該段序列中某位點的堿基C突變?yōu)镚【答案】AC利用雙脫氧測序法時，PCR反應體系中加入的模板是待測的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A正確；電泳時，產物的片段越大，遷移速率越慢，B錯誤；分析電泳結果，以對照個體的一條鏈為模板復制的子鏈序列為5'-CTACCCGTGAT-3'，模板鏈序列為5'-ATCACGGGTAG-3'，同理患者的子鏈序列為5'-CTACCTGTGAT-3'，模板鏈序列為5'-ATCACAGGTAG-3'，對比可知，患者該段序列中某位點的堿基G突變?yōu)锳，C正確，D錯誤。(2024新課標，5，6分)某種二倍體植物的P1和P2植株雜交得F1，F(xiàn)1自交得F2。對個體的DNA進行PCR檢測，產物的電泳結果如圖所示，其中①~⑧為部分F2個體，上部2條帶是一對等位基因的擴增產物，下部2條帶是另一對等位基因的擴增產物，這2對等位基因位于非同源染色體上，下列敘述錯誤的是()A.①②個體均為雜合體，F(xiàn)2中③所占的比例大于⑤B.還有一種F2個體的PCR產物電泳結果有3條帶C.③和⑦雜交子代的PCR產物電泳結果與②⑧電泳結果相同D.①自交子代的PCR產物電泳結果與④電泳結果相同的占1/2【答案】D由題意可知，電泳結果中，上部2條帶為一對等位基因的擴增產物(假設依次為A、a)，下部2條帶為另一對等位基因的擴增產物(假設依次為B、b)，這兩對等位基因位于非同源染色體上，則可推知F1基因型為AaBb，AaBb自交所得F2中，①的基因型為AaBB，②的基因型為Aabb，二者均為雜合體，③基因型為AABb，占比為1/8，⑤基因型為AABB，占比1/16，A正確；④⑥⑦⑧的基因型分別為aaBB、AAbb、aabb和AaBb，故F2中還有一種基因型為aaBb的個體，其PCR產物電泳結果有3條帶，B正確；③(AABb)與⑦(aabb)雜交子代的基因型為AaBb和Aabb，其中Aabb對應圖中的②，AaBb對應圖中的⑧，C正確；①(AaBB)自交子代(1/4AABB、1/2AaBB和1/4aaBB)的PCR產物電泳結果與④(aaBB)電泳結果相同的占1/4，D錯誤。(2024山東，5，2分)制備熒光標記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP)的反應管①~④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有()A.①②B.②③C.①④D.③④【答案】D反應管②和④雖然只有一種單鏈，但是單鏈含回文序列，可以同種單鏈之間發(fā)生互補，四個反應管中單鏈DNA互補配對情況如圖所示:由圖分析可知，D正確。(2023廣東，11，2分)“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是:裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是()A.裂解:使細胞破裂釋放出DNA等物質B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質等C.沉淀:可反復多次以提高DNA的純度D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色【答案】DDNA的粗提取與鑒定實驗中，通過研磨破碎細胞，使細胞裂解釋放DNA等物質，A正確；粗提取的DNA中可能會含有蛋白質、多糖、RNA等雜質，通過分離可以去除混合物中的雜質，B正確；根據(jù)DNA和蛋白質等在95%的冷酒精中的溶解度不同，可反復多次沉淀來提高DNA的純度，C正確；DNA鑒定時，DNA溶液加入二苯胺試劑后，需要沸水浴加熱才會變藍，D錯誤。(2023福建，4，2分)關于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”(實驗Ⅰ)和“DNA的粗提取與鑒定”(實驗Ⅱ)的實驗操作，下列相關敘述正確的是()A.實驗Ⅰ中，PCR實驗所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進行高壓滅菌處理B.實驗Ⅰ中，將擴增得到的PCR產物進行凝膠電泳，加樣前應先接通電源C.實驗Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNAD.實驗Ⅱ中，將白色絲狀物直接加入二苯胺試劑中并進行沸水浴，用于鑒定DNA【答案】C為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗時使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理，但移液器不需要，A錯誤；在將擴增得到的PCR產物進行凝膠電泳時，應先加樣，然后接通電源，B錯誤；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，因此取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后，析出的白色絲狀物即粗提取的DNA，C正確；鑒定DNA時，需要把白色絲狀物溶解在2mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺試劑進行沸水浴，D錯誤。(2023遼寧，19，3分)(不定項)基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9是癌細胞轉移的關鍵酶。MMP2和MMP9可以降解明膠，明膠可被某染液染成藍色，因此可以利用含有明膠的凝膠電泳檢測這兩種酶在不同條件下的活性。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是()A.SDS可以提高MMP2和MMP9活性B.10℃保溫降低了MMP2和MMP9活性C.緩沖液用于維持MMP2和MMP9活性D.MMP2和MMP9降解明膠不具有專一性【答案】B由題意知，MMP2和MMP9能降解明膠，明膠可被某染液染成藍色，所以白色條帶越細，酶的分解能力越弱，與37℃保溫+緩沖液組相比，SDS+37℃保溫+緩沖液組MMP2和MMP9對應的白色條帶變細，說明MMP2和MMP9活性降低，A錯誤；據(jù)圖可知，10℃保溫下，白色條帶最細，說明MMP2和MMP9活性降低，B正確；緩沖液是為了維持電泳系統(tǒng)pH相對穩(wěn)定，C錯誤；MMP2和MMP9降解明膠專一性的檢測缺乏其他酶或底物的對照，不能證明有無專一性，D錯誤。(2022山東，13，2分)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是()A.過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質【答案】B由于在低溫條件下DNA酶的活性較低，因此過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；DNA存在于上清液中，離心研磨液是為了使蛋白質等沉淀，B錯誤；沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C正確；并非所有蛋白質都可溶于冷酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。(2022北京，13，2分)下列高中生物學實驗中，對實驗結果不要求精確定量的是()A.探究光照強度對光合作用強度的影響B(tài).DNA的粗提取與鑒定C.探索生長素類調節(jié)劑促進插條生根的最適濃度D.模擬生物體維持pH的穩(wěn)定【答案】B教材實驗中，探究光照強度對光合作用強度的影響需利用盛圓形小葉片的燒杯與光源的距離來調節(jié)光照強度，觀察并記錄同一時間段內各實驗裝置中圓形小葉片浮起的數(shù)量，A不符合題意；利用95%的冷酒精將DNA與蛋白質分離，可粗提取DNA，用二苯胺試劑定性鑒定DNA，B符合題意；探索生長素類調節(jié)劑促進插條生根的最適濃度需要精確定量生長素類調節(jié)劑的濃度，C不符合題意；模擬生物體維持pH的穩(wěn)定實驗中，需準確測定加入酸或堿后不同實驗材料pH的變化，D不符合題意。(2021山東，13，2分)粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是()A.加入適量的木瓜蛋白酶B.37~40℃的水浴箱中保溫10~15分鐘C.加入與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精D.加入NaCl調節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L【答案】A加入適量的木瓜蛋白酶能分解濾液中的主要雜質——蛋白質，有助于提高白色絲狀物的DNA相對含量，A符合題意；37~40℃達不到破壞蛋白質所需的溫度，所選溫度應該是60~75℃，此溫度能夠破壞濾液中主要雜質蛋白質的結構，進而去除這些雜質，有助于提高白色絲狀物的DNA相對含量，B不符合題意；與濾液體積相等的、體積分數(shù)為95%的冷卻的酒精是題干中的“特定試劑”，C不符合題意；加入NaCl調節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L，經(jīng)過以上處理后DNA析出，過濾后DNA主要存在于紗布上的過濾物中，在濾液中含量極少，經(jīng)過D項處理后應過濾去除溶液中的雜質，再用物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，有助于提高白色絲狀物的DNA相對含量，D不符合題意。(2024浙江1月選考，22，13分)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達并定位于細胞質膜，具有吸收和轉運環(huán)境中Zn2+的功能。為研究該植物2種鋅轉運蛋白M和N與吸收Zn2+相關的生物學功能，在克隆M、N基因基礎上，轉化鋅吸收缺陷型酵母，進行細胞學鑒定?；卮鹣铝袉栴}:(1)鋅轉運蛋白基因M、N克隆。以該植物為材料提取并純化mRNA，反轉錄合成cDNA。根據(jù)序列信息設計引物進行PCR擴增，PCR每個循環(huán)第一步是進行熱變性處理，該處理的效果類似于生物體內的作用效果。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳時，DNA分子因為含而帶負電荷，凝膠點樣孔端應靠近電泳槽負極接口；當2個PCR產物相對分子質量接近時，若延長電泳時間，凝膠中這2個條帶之間的距離會?；厥誅NA片段，連接至克隆載體，轉化大腸桿菌，測序驗證。

(2)重組表達載體構建。分別將含M、N基因的重組質粒和酵母表達載體同時進行雙酶切處理，然后利用連接，將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌。用PCR快速驗證重組轉化是否成功。此反應可以用大腸桿菌懸液當模板的原因是。

(3)酵母菌轉化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，直接在固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，活化后接種至液體培養(yǎng)基，采用以擴大菌體數(shù)量，用重組表達載體轉化酵母菌。檢測M、N基因在受體細胞中的表達水平，無顯著差異。

(4)轉基因酵母功能鑒定。分別將轉化了M、N基因的酵母菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液用法逐級稀釋至OD600為0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液。用涂布器均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天，菌落生長如圖。該實驗中陰性對照為。由實驗結果可初步推測:轉運蛋白M和N中，轉運Zn2+能力更強的是，依據(jù)是。

注:OD600為波長600nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高；空載體為未插入M或N基因的表達載體?！敬鸢浮?1)根解旋酶磷酸基團變長(2)DNA連接酶熱變性使大腸桿菌細胞破裂，DNA流出(3)劃線振蕩培養(yǎng)(4)梯度稀釋鋅吸收缺陷型酵母+空載體N轉入N基因的這組酵母菌數(shù)量多解析(1)鋅轉運蛋白在某種植物根部細胞特異性表達，說明鋅轉運蛋白基因在該種植物根部細胞可轉錄出mRNA，再以mRNA為模板翻譯出鋅轉運蛋白，所以進行鋅轉運蛋白基因M、N克隆時，可以該植物根為材料提取并純化mRNA，反轉錄合成cDNA。PCR中熱變性處理時溫度超過了90℃，雙鏈DNA解旋為2條單鏈，該處理的效果類似于生物體內解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基團故帶負電荷。在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小等有關，當2個PCR產物相對分子質量接近時，電泳時間過短會導致2個PCR產物分離不完全，而延長電泳時間可使2個PCR產物即凝膠中相應2個條帶之間的距離變長。(2)構建重組表達載體時，先分別將含M、N基因的重組質粒和酵母表達載體同時進行雙酶切處理，以得到相同的黏性末端或平末端，再利用DNA連接酶連接。將得到的重組表達載體轉化大腸桿菌，用PCR快速驗證重組轉化是否成功，此反應可以用大腸桿菌懸液當模板的原因是若轉化成功，則大腸桿菌的DNA中含有M、N基因，熱變性會使大腸桿菌細胞破裂，DNA流出。(3)菌株一般低溫保存于固體培養(yǎng)基上故取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，可直接在固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)。有氧條件下，酵母菌可以大量繁殖，故活化后接種至液體培養(yǎng)基，可采用振蕩培養(yǎng)以擴大菌體數(shù)量。(4)可采用梯度稀釋法對菌液逐級稀釋。該實驗中陰性對照為鋅吸收缺陷型酵母+空載體，其不含M、N基因。由“OD600為波長600nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高”及題圖中相同吸光值下(OD0.006和OD0.0006)，鋅吸收缺陷型酵母+N基因表達載體組酶母菌數(shù)量明顯多于鋅吸收缺陷型酵母+M基因表達載體組，可知，轉運蛋白M和N中，轉運Zn2+能力更強的是N。(2023江蘇，22，12分)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題:圖1(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有，擴增程序中最主要的不同是。

(2)有關基因序列如圖2。引物F2-F、F1-R應在下列選項中選用。

圖2A.ATGGTGCAACCA C.GACGAGCTGCAGB.TGGTTGCACCAT D.CTGCAGCTCGTC(3)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有。

(4)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有。

A.稀釋涂布平板需控制每個平板30~300個菌落B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化圖3(5)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板，用引物F1-F和F2-R進行了PCR擴增，質粒P1~P4的擴增產物電泳結果如圖3。根據(jù)圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有。

(6)對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是。

【答案】(1)模板、PCR引物反應時間(2)CD(3)限制酶、DNA連接酶(4)ABC(5)P3、P4(6)電泳只能測定DNA長度，不能確定堿基序列是否產生突變解析(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有:模板分別是片段F1、片段F2；引物分別是F1-R和F1-F、F2-R和F2-F，最主要的不同是反應時間(反應時間與模板長短有關)。(2)由題中信息，畫出F1與F2片段相接的序列如圖所示:F2-F和F1-R應與F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1與F2片段相接處)相同或互補，C、D所給序列符合要求；而A項序列左右兩端分別與F1片段上游序列和F2片段下游序列相同，B項序列左右兩端分別與F2片段下游序列和F1片段上游序列互補，故A、B不符合要求。(3)重組酶可以依據(jù)PCR擴增序列和線性載體兩端的同源序列進行同源重組，不需要使用限制酶和DNA連接酶構建基因表達載體。(4)該過程的目的不是計數(shù)，所以無需控制每個平板30~300個菌落，A錯誤；抗性平板上未長出菌落，一般因為沒有導入含抗性基因的質粒，B錯誤；含有抗生素的培養(yǎng)基可篩選出成功轉化的大腸桿菌，不會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯誤；單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物，在抗性平板上長出的單菌落一般無需進一步劃線純化，D正確。(5)EGFP長度為720bp，AnB1長度為390bp，二者的總長度為720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R進行PCR擴增，其長度接近于P1、P2的擴增產物，根據(jù)圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有P3、P4。(6)電泳技術僅能用于分析待檢測DNA分子的長度，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列是否發(fā)生突變，因此對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認。(2022江蘇，24，12分)纖毛是廣泛存在的細胞表面結構，功能異?？梢l(fā)多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機制具有重要意義。請回答下列問題。圖Ⅰ(1)纖毛結構如圖Ⅰ所示，由細胞膜延伸形成的纖毛膜主要由組成?；w由中心體轉變而來，中心體在有絲分裂中的功能是。

(2)某病人腎小管上皮細胞纖毛異常，為了分析纖毛相關基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進行了PCR擴增與產物測序。從細胞樣品中分離DNA時，可通過交替調節(jié)鹽濃度將與核蛋白結合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0mol/L的目的是。PCR擴增時，需在催化下，在引物的端進行DNA鏈的延伸，獲得擴增產物用于測序。

(3)為研究蛋白質X在細胞中的定位，構建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可指示其在細胞內位置。將X-GFP基因融合片段M導入如圖Ⅱ所示載體質粒Y，構建Y-M重組質粒(在EcoRⅤ位點插入片段)。請完成下表。圖Ⅱ圖Ⅲ分步實驗目標簡易操作、結果、分析PCR鑒定正向重組質粒Y-M①選擇圖Ⅱ引物；②PCR目的產物約為bp

確保M及連接處序列正確③質粒測序，圖Ⅲ中正確的是(選填序列編號)

檢測融合蛋白定位④對照質粒Y-GFP(僅表達GFP)與實驗質粒Y-M分別導入細胞，發(fā)現(xiàn)對照組整個細胞均有綠色熒光而實驗組熒光集中在纖毛基部，說明

(4)為研究另一纖毛病相關基因Z表達的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)形成cDNA作為模板，PCR擴增結果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產物熒光強度達到設定閾值時的PCR循環(huán)數(shù))。從理論上估算，在PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的倍。

【答案】(1)脂質和蛋白質發(fā)出星射線，形成紡錘體(2)溶解DNATaqDNA聚合酶(或耐高溫的DNA聚合酶)3'(3)①a、b②1100③Q4④蛋白X定位于纖毛基部(4)逆轉錄32解析(1)纖毛膜由細胞膜延伸形成，細胞膜的組成成分主要是脂質和蛋白質；在低等植物和動物細胞有絲分裂的前期，中心體發(fā)出星射線，形成紡錘體。(2)DNA在2.0mol/L的NaCl溶液中溶解度很高，常用該濃度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是體外大量擴增DNA分子的技術，PCR過程需要TaqDNA聚合酶(或耐高溫的DNA聚合酶，可催化DNA子鏈的延伸)、引物(在PCR過程中為TaqDNA聚合酶提供3'-OH，使該酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸)、四種游離的脫氧核苷酸(合成DNA子鏈的原料)、緩沖液(提供液體環(huán)境及離子條件)、DNA母鏈(DNA復制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接結果如圖:用PCR鑒定是否為正向重組質粒Y-M，可選用引物a和引物b，目的產物約為1100bp。若M與載體質粒Y正確連接，則上游連接處含有HindⅢ+EcoRⅤ的識別序列，即5'…AAGCTT…GATATC…3'，即Q4，下游含有EcoRⅤ+BamHⅠ的識別序列，即5'…GATATC…GGATCC…3'，即質粒測序正確的是Q4。本實驗的目的是借助綠色熒光蛋白檢測蛋白質X在細胞中的位置，則實驗組導入的是質粒Y-M(M為X-GFP基因融合片段)，表達X-GFP，對照組導入僅表達GFP的質粒Y-GFP，依據(jù)實驗組綠色熒光集中在纖毛基部，而對照組整個細胞均有綠色熒光，可知蛋白X定位于纖毛基部。(4)提取細胞的總RNA，經(jīng)逆轉錄獲得cDNA，cDNA作為熒光定量PCR的模板。熒光定量PCR過程中，特定PCR循環(huán)次數(shù)下產物產生的熒光強度與模板量呈正相關，雖然限定了總cDNA模板量相等，但要注意由于健康人和病人基因Z的轉錄水平不同，相應的mRNA含量不同，因此基因Z的cDNA含量并不相同，設健康人基因Z的cDNA模板量為x，病人的為y，由“健康人Ct值為15，而病人Ct值為20”知，x×215=y×220，PCR擴增20個循環(huán)的產物中，健康人樣品的目的產物大約是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220