《應用微生物學》PPT課件

1、應用微生物學,AppliedMicrobiology,應用微生物學,概論微生物的生長微生物的代謝微生物的遺傳與遺傳育種微生物基因工程應用微生物的基因操作系統(tǒng)酶工程與生物轉(zhuǎn)化微生物發(fā)酵微生物代謝工程,概論,基本概念應用微生物學的發(fā)展微生物細胞的結(jié)構(gòu)重要的應用微生物,定義,應用微生物學:以一定的直接或間接應用目標研究微生物及其相互作用和與環(huán)境的作用的科學。(appliedmicrobiology)微生物學與相關的生物技術相結(jié)合，以實現(xiàn)一定的直接或間接應用目標。(microbiologyinapplication),微生物的特點,資源量大（多樣性豐富）生物量大（生長迅速）可塑性大（便于操作）個體?。?/p>

2、便于運輸、攜帶）完成自然界的物質(zhì)循環(huán)造福人類引起災難,當前人類面臨的問題,資源的壓力環(huán)境的挑戰(zhàn)傳染病的新生與復發(fā),微生物的應用部分,細胞基因基因產(chǎn)物（酶、蛋白質(zhì)）代謝產(chǎn)物,應用微生物學需解決的問題,微生物菌種的獲得和優(yōu)化微生物培養(yǎng)條件的建立和優(yōu)化微生物的應用,應用微生物學研究的一般流程,提出問題（工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、健康、國防）微生物？NoYes菌種解決問題發(fā)酵解決問題應用解決問題,應用微生物學的發(fā)展微生物學的發(fā)展是與應用緊密聯(lián)系的,逐步建立方法認識微生物Leenwenhock(1673)顯微鏡Jenner(1798)牛痘Basteur(1860s)發(fā)酵、低溫滅菌、自然發(fā)生Koch(1881)純

3、培養(yǎng)微生物形成產(chǎn)業(yè)Fleming(1929)青霉素Waksman(1944)鏈霉素現(xiàn)代生物技術Cohen(1972)DNA重組,微生物細胞的結(jié)構(gòu),細胞壁形態(tài)保持、物質(zhì)交換、信號識別細胞膜轉(zhuǎn)運細胞質(zhì)酶、反應場所細胞核遺傳物質(zhì)核外遺傳物質(zhì)線粒體、質(zhì)粒,重要的應用微生物,病毒：-噬菌體細菌：大腸桿菌(E.coli)棒桿菌(Corynebacterium)放線菌：鏈霉菌(Streptomyces)酵母菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisia)真菌：曲霉(Aspergillus),第一章微生物的生長,微生物生長的條件培養(yǎng)基生長動力學,微生物細胞的化學組成,細胞中幾種主要元素的含量(干重

4、的百分數(shù)),細胞干物質(zhì)中主要組分和含量(%),微生物生長的條件物質(zhì)條件,水a(chǎn)w=P/P0,微生物生長的條件物質(zhì)條件,碳源和氮源OHPSKCaMgFeMnCuZnMoCoNiVBClNaSi維生素、氨基酸等,微生物生長的條件環(huán)境條件,pH中性（弱酸、堿）、嗜酸、嗜堿溫度最適、生長、耐受氧氣嚴格（專性）好氧、兼性、耐氧厭氧、嚴格厭氧壓力滲透壓極端環(huán)境微生物(extremophile)不可培養(yǎng)微生物(VBNCvivebutnon-cultured),極端微生物與不可培養(yǎng)微生物,極端環(huán)境微生物(extremophile):依賴于一種或多種極端物化因子生存的微生物嗜熱菌：50-80C(hyperther

5、mophiles80C)嗜冷菌：9嗜鹽菌：3M嗜壓菌不可培養(yǎng)微生物(VBNCvivebutnon-cultured),培養(yǎng)基提供微生物生長所需物質(zhì)與環(huán)境條件的體系,培養(yǎng)基的組成要素,碳源、氮源、提供各種元素的無機鹽生長因子或含生長因子的物質(zhì)水、固化基（固體培養(yǎng)基）pH、滲透壓（糖、鹽濃度）、滅菌條件,培養(yǎng)基的種類,按物理狀態(tài)：固體、液體、半固體按化學組成：合成、豐富、半合成按使用目的：種子、發(fā)酵、篩選、再生、富集,培養(yǎng)基的選擇和設計原則,適用：利于達到目的利于下游工藝重復性好經(jīng)濟：原料價格原料用量全工藝綜合平衡安全：環(huán)境影響生物安全培養(yǎng)基的選擇和設計是應用微生物學研究的重要內(nèi)容,生長動力學,增

6、值曲線（Multiplicationcurve）：細胞數(shù)-時間生長曲線（growthcurve）：細胞量-時間,微生物生長的實驗計量,顯微計數(shù)菌落計數(shù)濁度測定細胞干重,微生物生長的數(shù)學描述,比生長速度(specificgrowthrate)=dx/xdt細菌0.6-1.2酵母菌0.3-0.5放線菌0.1-0.3真菌0.1-0.3生物量倍增時間(biomassdoublingtime)td=ln2/增值度(multiplicationdegree)x/xo,第二章微生物的代謝,微生物初級代謝微生物次級代謝代謝調(diào)節(jié),微生物的代謝,微生物細胞所進行的生化反應的總和物質(zhì)代謝細胞內(nèi)及細胞與環(huán)境間的物質(zhì)轉(zhuǎn)

7、換的過程能量代謝載體信息代謝,微生物初級代謝,微生物從環(huán)境攝取物質(zhì)、獲得能量、合成自身新物質(zhì)的過程營養(yǎng)物廢棄物能量（用于生長）能量合成代謝（用于運動和物質(zhì)轉(zhuǎn)運）細胞組分酶分解代謝能量來源,重要的初級代謝途徑,糖酵解途徑糖代謝的共同分解途徑三羧酸循環(huán)將糖最終氧化為二氧化碳和水，并產(chǎn)生大量能量磷酸戊糖途徑產(chǎn)生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多種中間產(chǎn)物ED途徑細菌代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇的途徑氨基酸合成途徑,糖酵解途徑(Embden-Meyerhofpathway),GLCHXKZWFSOLGNDG6PG15LP6GRU5PPGIF6PPFKFBPF16PFBAGLYG3PDHAPGAPTPITDHP13GPG

8、K3PGGPM2PGENOPEPPYKPDCADHPYRACAETH,三羧酸循環(huán)(Krebscycle),PYRACoAMDHCITMALOAACTTFUMACOFUMICISDHOSMIDPSUCSUCCAKGLSCKGD,磷酸戊糖途徑,氧化（產(chǎn)生NADPH）RU5PP6GG15LG6PRKIRPE非氧化R5PX5P（分子重排）TKLTKLGAPS7PE4PTKLF6P,ED途徑,存在于某些缺乏完整EMP途徑的微生物中，是微生物特有的,將2-酮-3脫氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解為丙酮酸和3-磷酸甘油醛。,氨基酸合成途徑,GLC3PGSer,Gly,Met（3磷酸甘油酸衍生型）PPPR5

9、PPEPPhe,Try,Trp（芳香族氨基酸）HisPRYAla,Val,Leu（丙酮酸衍生型）OAAAspASALys（草酰乙酸衍生型）TCAAsnHSThrAKGMetIleArgGluGln（酮戊二酸衍生型）Pro,微生物次級代謝,次級代謝是相對于初級代謝的概念，指微生物在一定的生長時期（一般為穩(wěn)定期）以初級代謝物為前體、合成對微生物生命活動沒有明確功能的物質(zhì)的過程。次級代謝（前體聚合、初級代謝結(jié)構(gòu)修飾、裝配）營養(yǎng)物前體次級代謝物（初級代謝物）,次級代謝的生物學意義,次級代謝的生理意義目前尚無定論，但它肯定對微生物是有意義的，否則這種需要多種酶類協(xié)同參與、并在精細的調(diào)節(jié)機制控制之下的代謝

10、過程是不會在生物體內(nèi)保存下來的。維持初級代謝的平衡次級代謝產(chǎn)物作為儲藏物質(zhì)的一種形式使菌體在生存競爭中占優(yōu)勢與細胞分化有關,青霉素,SCH3R-CO-NH-HCCHCBACH3OC-N-CHCOOH側(cè)鏈：R-CO-母核：噻唑環(huán)A，-內(nèi)酰胺環(huán)B,青霉素的生物合成,代謝調(diào)節(jié),細胞為維持正常的生理功能，它的組分、代謝物、能量和電子載體的合成大體上應保持恒定。當環(huán)境或細胞自身發(fā)生某種變化時，可以通過一定的反饋作用來達到平衡生長，這種反饋作用即代謝調(diào)節(jié)。,代謝調(diào)節(jié)的位點,DNARNA酶底物底物產(chǎn)物（營養(yǎng)物）（或中間物）底物進入，酶的活性，酶的合成,代謝調(diào)節(jié)的本質(zhì)：酶的調(diào)節(jié),酶合成的調(diào)節(jié)：誘導與阻遏基因水

11、平酶活性的調(diào)節(jié)：反饋抑制蛋白質(zhì)水平,適應現(xiàn)象,例1，大腸桿菌乳糖代謝：半乳糖苷酶乳糖-半乳糖+葡萄糖E.coli生長于無乳糖培養(yǎng)基，半乳糖苷酶：3分子/細胞E.coli生長于含乳糖培養(yǎng)基，半乳糖苷酶：3000-5000分子/細胞例2，大腸桿菌色氨酸代謝：E.coli生長于無色氨酸培養(yǎng)基，合成色氨酸合成酶，當色氨酸濃度增加時，色氨酸合成酶濃度下降。細胞需要某種酶時才合成，反映出細胞的自我調(diào)節(jié)機理。這種誘導物誘導可誘導酶的產(chǎn)生與輔抑物抑制可阻遏酶的產(chǎn)生的現(xiàn)象稱適應現(xiàn)象。乳糖：誘導物(inducer)色氨酸：輔抑物(corepressor),底物與誘導物,底物不等于誘導物,乳糖操縱子,iPOZYA調(diào)

12、節(jié)基因i：編碼阻遏蛋白啟動子P：有CAP(CAP與cAMP復合物)和RNase兩個位點操縱基因O：阻遏蛋白結(jié)合位點結(jié)構(gòu)基因LacZ：半乳糖苷酶LacY：半乳糖苷透性酶LacA：半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶,協(xié)同誘導和順序誘導,協(xié)同誘導Ia、b、cabc順序誘導ABCDIaBbCc,操縱子(operon),IPOS1S2S3調(diào)節(jié)基因啟動基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因變構(gòu)(+or-)外界信號調(diào)節(jié)蛋白IorCoR操縱子：一組功能相關的基因共同組成的轉(zhuǎn)錄單位，它們結(jié)構(gòu)上緊密聯(lián)系、功能上協(xié)同表達，接受同一調(diào)控序列的調(diào)控。,誘導與阻遏,調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白活性操縱子結(jié)構(gòu)基因酶合成誘導正打開表達誘導負打開表達阻遏正關閉不表達阻遏負關閉不

13、表達,反饋抑制,反饋抑制：在合成代謝途徑中，代謝終產(chǎn)物抑制途徑中第一個酶的作用。E1E2E3E4ABCDE反饋抑制能對環(huán)境變化做出快速反應特點：1，只有終產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物有反饋抑制2，受抑制的是途徑中的第一個酶3，反饋抑制是可逆的,別構(gòu)酶(allostericenzyme),有多亞基和四級結(jié)構(gòu)有結(jié)合底物的活性中心和結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心活性中心和別構(gòu)中心在酶分子的不同部位,分支生物合成途徑的調(diào)節(jié),P1ABCP2協(xié)同反饋抑制同功酶反饋抑制累積反饋抑制順序反饋抑制（細調(diào)）,協(xié)同反饋抑制,P1ABCP2合成代謝途徑中的第一個酶有幾個變構(gòu)中心，分別可與不同終產(chǎn)物結(jié)合，每一種終產(chǎn)物對第一個酶都沒有反饋抑

14、制作用，只有當幾種終產(chǎn)物同時過量時才有反饋抑制作用。,同功酶反饋抑制,P1ABCP2合成代謝途徑中的第一個酶有幾種結(jié)構(gòu)略有不同的同功酶，每一種終產(chǎn)物只對一種同功酶有反饋抑制作用，只有當幾種終產(chǎn)物同時過量時，才使幾種同功酶同時被作用而抑制合成反應。,積累反饋抑制,P1ABCP2每一種終產(chǎn)物對第一個酶都有一定的反饋抑制作用，他們合在一起達到最大程度的反饋抑制。,順序反饋抑制,P1ABCP2合成代謝途徑中的第一個酶的效應物不直接是終產(chǎn)物而是代謝分支點的中間物，每一種終產(chǎn)物抑制分支后的第一個酶，使分支點的中間物積累，然后抑制合成代謝途徑的第一個酶。這一調(diào)節(jié)作用可根據(jù)不同終產(chǎn)物的量分別調(diào)節(jié)，是一種細調(diào)。

15、在許多分支代謝的調(diào)節(jié)中，細調(diào)與粗調(diào)往往同時發(fā)生。,第三章微生物的遺傳與菌種選育,微生物的遺傳物質(zhì)基因突變基因重組遺傳育種,微生物的遺傳物質(zhì),核酸(DNARNA)染色體染色體外遺傳物質(zhì),DNA是遺傳物質(zhì)的實驗證明,肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化S-dead，S-alive，R-aliveSdead-S-SR噬菌體感染T2(DNA-32P,protein-35S)-E.coli-上清T2（35S）沉淀E.coli（32P）雙螺旋模型,遺傳育種,基本過程基因突變、重組、導入、敲除篩選出發(fā)菌株包含變異株的群體優(yōu)良變異株目的株檢驗檢驗產(chǎn)生變異株選擇變異株檢驗變異株,基因突變,遺傳物質(zhì)小范圍的改變，只涉及一對或少數(shù)幾對堿

16、基，又稱點突變。,基因突變的類型,基因型置換：GA,CT轉(zhuǎn)換(transition)；G,AC,T顛換(transversion)移碼(frameshift)：DNA分子中一對或幾對核苷酸的增加或缺失表型形態(tài)：造成形態(tài)發(fā)生改變的突變致死：造成個體死亡或生活力下降（半致死）的突變條件致死：在一定條件下有致死效應的突變生化：沒有形態(tài)效應的突變，如營養(yǎng)缺陷、抗藥性等翻譯同義、錯義、無義(UAG,UGA,UAA),基因突變的特性,稀有性突變率低（可通過理化處理提高突變率）隨機性獨立性Kmr10-5,Apr10-6,KmrApr10-11可逆性回復突變率也很低穩(wěn)定性突變率：一個世代或一定時間內(nèi)發(fā)生突變的

17、概率。,幾種微生物每次復制的突變率,誘變劑,能引起微生物遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的化學物理因子化學：堿基類似物（5-溴尿嘧啶、羥胺、亞硝酸）烷化劑（亞硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外線）射線（X-射線、射線）,誘變劑的作用,基因突變的應用-誘變育種,雖然分子生物學技術已普遍用于育種，誘變育種仍是重要而基本的育種方法。誘變育種的基本步驟：出發(fā)株誘變劑處理初篩復篩鑒定一般要進行多次，以積累有益突變。誘變譜系：誘變劑處理1誘變劑處理2出發(fā)株中間株1中間株2目的株,誘變育種的關鍵環(huán)節(jié),出發(fā)株：性狀、潛力誘變處理：誘變劑選擇、劑量篩選：方法、篩選量High-throughputscreening,致死率與誘

18、變效果,突變株的篩選,初篩：棄去大量無價值菌株復篩：選出少數(shù)有價值菌株方法：直接測定利用可觀察現(xiàn)象營養(yǎng)限制培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基,組成型育種,半乳糖苷酶加誘導酶抑制劑培養(yǎng)基：乳糖+鄰硝基-D-巖藻糖苷（誘導型酶抑制劑）只有組成型能利用乳糖交替培養(yǎng)法培養(yǎng)基1：乳糖培養(yǎng)基2：葡萄糖交替培養(yǎng)使組成型優(yōu)勢擴大,交替培養(yǎng)法,營養(yǎng)缺陷型育種,營養(yǎng)缺陷型C-ABCB積累ABCD積累D,抗反饋抑制育種,原理：產(chǎn)物+酶（結(jié)合于調(diào)節(jié)中心）反饋抑制類似物+酶（結(jié)合于調(diào)節(jié)中心）影響生長抗類似物的變異株類似物與酶的調(diào)節(jié)中心不能結(jié)合產(chǎn)物與酶的調(diào)節(jié)中心不能結(jié)合反饋抑制解除產(chǎn)物能過量積累,抗反饋抑制育種舉例,蘇氨酸C.crenatumAS1.5420mg/mlMNNGLR-1458AHVr6mg/mlA)：使G的7位和A的3位N部分甲基化，中性pH加熱，G(少量A)堿基脫落，再用0.1molNaOH處理，加熱到90C使糖基脫落硫酸二甲酯處理后加稀酸:A先斷裂(AG)，再用0.1molNaOH處理，加熱到90C使糖基脫落DNA與肼反應(C+T)：C、T脫落成核糖脲，與哌啶作用在C、T處切斷DNADNA與肼反應時加2MNaCl(C)：可抑制T脫落,雙脫氧法,4種反應體系中摻入ddATP、ddCTP、ddGT