RNAi和siRNA轉(zhuǎn)染.ppt

1、感謝下載,1,RNAi和siRNA轉(zhuǎn)染,感謝下載,2,內(nèi) 容,第一部分 RNAi實驗基本概念 第二部分 RNAi實驗具體設(shè)計 第三部分 siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答,感謝下載,3,第一部分RNAi實驗基本概念,感謝下載,4,主要內(nèi)容,1.RNAi的概念 2.RNAi的啟動途徑 3.非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗 4.哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗 5.RNAi效應(yīng)表現(xiàn),感謝下載,5,1.RNAi的概念,RNA干擾(RNA interference)是雙鏈RNA（dsRNA)特異性地結(jié)合到與之序列互補的mRNA上，導(dǎo)致mRNA降解，從而介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平基因表達抑制。,感謝下載,6,2006年度諾貝爾

2、生理學或醫(yī)學獎共同授予安德魯菲爾和克雷格梅洛，他們發(fā)現(xiàn)了“RNA干擾機制雙鏈RNA沉默基因”。,感謝下載,7,2.RNAi的啟動途徑,(1) dsRNA途徑 (2) siRNA途徑 (3) shRNA表達載體途徑,感謝下載,8,(1) dsRNA途徑,dsRNA:在非哺乳動物系統(tǒng)中，大于30bp的長雙鏈RNA(dsRNA)進入細胞后，經(jīng)過胞質(zhì)內(nèi)雙鏈特異性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，進一步導(dǎo)致RNAi的發(fā)生。 但在絕大多數(shù)哺乳動物系統(tǒng)中，超過30bp的dsRNA會引起細胞潛在的抗病毒機制（干擾素效應(yīng)）降解dsRNA。,感謝下載,9,(2) siRNA途徑,小干擾RNA，長2

3、1-23bp，雙鏈。 作用機制：雙鏈的siRNA解鏈并裝配入RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，siRNA的反義鏈引導(dǎo)RISC與mRNA分子互補結(jié)合，并降解mRNA，最終導(dǎo)致特定基因表達的抑制。,感謝下載,10,(3) shRNA表達載體途徑,shRNA（short hairpin RNA）表達載體在細胞內(nèi)表達shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，導(dǎo)致RNAi的發(fā)生。可能具有細胞毒性。,shRNA可能通過競爭Exportin-5造成致命毒性,感謝下載,11,3.非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗,如線蟲、果蠅等不涉及抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，可通過與靶基因序列互補的長鏈dsRNA（通常200

4、bp）介導(dǎo)RNAi的發(fā)生 。 長鏈dsRNA通?？梢酝ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄獲得。 長鏈dsRNA進入細胞后可被Dicer酶水解為多個混合的siRNA，敲除效果更好。,感謝下載,12,4.哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗,通過轉(zhuǎn)染siRNA：通常在3-7天可以維持較高的基因表達抑制效應(yīng)，效應(yīng)期的長短主要取決于細胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi實驗可以在此時間段獲得結(jié)果，而且可以通過再次轉(zhuǎn)染獲得超過1周的基因表達抑制時間。 通過轉(zhuǎn)染shRNA表達載體，可以獲得超過2周的基因表達抑制時間，在長效RNAi實驗時，選擇shRNA表達載體較為合適。,感謝下載,13,5.RNAi效應(yīng)表現(xiàn),RNAi效應(yīng)導(dǎo)致的

5、靶基因下調(diào)可在mRNA水平和蛋白水平表現(xiàn)，也可能會在細胞形態(tài)等生理學方面表現(xiàn)。,感謝下載,14,第二部分哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗設(shè)計,感謝下載,15,主要內(nèi)容,1. 需要短期抑制還是長效抑制? 2. 采用siRNA進行實驗的途徑 3. 構(gòu)建shRNA表達載體進行實驗 4. siRNA設(shè)計需要注意的問題 5. 脫靶效應(yīng) 6. 轉(zhuǎn)染是RNAi實驗的瓶頸,感謝下載,16,1.需要短期抑制還是長效抑制?,1周以內(nèi)，采用siRNA較好，無需構(gòu)建載體，節(jié)省時間，還可以采用2次轉(zhuǎn)染的方法，延長RNAi作用的時間到2周。 2周以上長效RNAi實驗，采用shRNA表達載體較好，效應(yīng)持續(xù)時間長。,感謝下載,17

6、,2. 采用siRNA進行實驗的途徑,化學合成：首選的siRNA制備方法，最快、最方便，成本高，適用于長期使用特定siRNA (2) 體外轉(zhuǎn)錄：費時，成本低，所需有效濃度低，適用于大量篩選siRNA Silencer siRNA Construction Kit（ThermoFisher） (3) Dicer/RNase酶解非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi 三種方法均可做熒光標記，可及時得知轉(zhuǎn)染效率,感謝下載,18,3.構(gòu)建shRNA表達載體進行實驗,需要構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒 可利用載體上的抗生素等標記篩選，做長效表達 不能做熒光標記，無法直觀知道轉(zhuǎn)染效率,感謝下載,19,4.siRNA設(shè)計需要注意的問題,(

7、1) siRNA序列設(shè)計 (2) 陰性對照的作用 (3) 陽性對照的重要性 (4) siRNA熒光標記的問題,感謝下載,20,(1) siRNA的設(shè)計,理想的siRNA序列是特異性強，抑制效率高。 可通過檢索相關(guān)基因的文獻報道序列，或者通過在線設(shè)計軟件進行，一些技術(shù)力量較強的化學合成公司可提供免費設(shè)計。 如果有可能，多設(shè)計幾條siRNA 序列，以篩選最特異、最有效的siRNA序列。,感謝下載,21,(2) 陰性對照siRNA的作用,陰性對照siRNA通常在進入細胞后不會引起任何基因表達的改變，從而反映出小分子RNA片段進入細胞后對基因表達的非特異影響。,感謝下載,22,(3) 陽性對照siRN

8、A的重要性,陽性對照siRNA采用確認有效的siRNA，針對某些較容易檢測基因，如甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因； 用于確認RNAi實驗過程的有效性，包括轉(zhuǎn)染條件、檢測方法是否可行等； 陽性對照siRNA在RNAi實驗初期或在新的轉(zhuǎn)染體系進行RNAi實驗時很重要，容易被忽視，缺乏陽性對照siRNA，實驗出問題無法找原因，耽誤時間。,感謝下載,23,(4) siRNA熒光標記的問題,采用熒光標記的siRNA可以用來確定轉(zhuǎn)染效率和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，這種方法操作快速，實驗費用也不高，但由于熒光標記的siRNA攝入與siRNA導(dǎo)致的抑制效果時常會出現(xiàn)不相關(guān)性，這種情況在某些細胞系和應(yīng)用某些轉(zhuǎn)染試劑

9、時，如脂質(zhì)體時更為嚴重。因此在應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時，不推薦使用熒光標記的siRNA。,感謝下載,24,5.RNAi Off-target(脫靶效應(yīng)),(1) 什么是RNAi Off-target(脫靶效應(yīng))? (2) 脫靶效應(yīng)如何檢測？ (3) siRNA濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？ (4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應(yīng)？ (5) 如何避免脫靶效應(yīng)？,感謝下載,25,(1) RNAi Off-target(脫靶效應(yīng))是什么？,RNAi Off-target(脫靶效應(yīng))：簡單地說，就是siRNA轉(zhuǎn)染中的非特異反應(yīng)，這不僅包括siRNA序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相關(guān)因素對轉(zhuǎn)染細胞的其他

10、相關(guān)基因發(fā)生非特異性的表達變化，從而導(dǎo)致假陽性和假陰性。目前已廣泛引起研究者重視。,感謝下載,26,(2) 脫靶效應(yīng)如何檢測？,多種方法可以用于預(yù)測和檢測脫靶效應(yīng)，最常見的方法是基因表達譜芯片的方法。,感謝下載,27,(3) siRNA濃度是否和脫靶效應(yīng)相關(guān)？,以前認為高濃度會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，實際上低濃度同樣會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。,感謝下載,28,(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應(yīng)？,有人采用基因芯片檢測對轉(zhuǎn)染試劑造成的細胞基因表達影響發(fā)現(xiàn)，某脂質(zhì)體L2K可以引發(fā)1908個基因的表達變化，既包括下調(diào)，也包括上調(diào)。如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導(dǎo)致某基因表達上調(diào)，可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后該基因可能會出現(xiàn)表達不

11、變甚至增強的現(xiàn)象，從而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導(dǎo)致某基因表達下調(diào)，則會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。,感謝下載,29,(5) 如何避免脫靶效應(yīng)？,脫靶效應(yīng)并不能絕對避免，但可以采取措施減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生，如針對同一靶基因設(shè)計2條以上抑制效率在70以上的不同siRNA序列，分別進行實驗，可避免siRNA造成的脫靶效應(yīng)；采用不同轉(zhuǎn)染試劑進行實驗可避免轉(zhuǎn)染試劑造成的脫靶效應(yīng)等。,感謝下載,30,6.轉(zhuǎn)染是RNAi實驗的瓶頸,轉(zhuǎn)染是siRNA實驗的瓶頸，轉(zhuǎn)染質(zhì)量的好壞直接關(guān)系RNAi實驗的成敗。 (1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則 (2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法 (3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類 (4) 脂

12、質(zhì)體 (5) 非脂質(zhì)體聚合物類,感謝下載,31,(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則,高轉(zhuǎn)染效率：較高的轉(zhuǎn)染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于實驗結(jié)果的觀察； 低細胞毒性：因為RNAi是抑制性實驗，轉(zhuǎn)染試劑的毒性多導(dǎo)致細胞凋亡等結(jié)果，這種結(jié)果是對細胞正常生理功能嚴重干擾（主要表現(xiàn)為抑制），細胞無法進行正常轉(zhuǎn)錄表達而出現(xiàn)凋亡。轉(zhuǎn)染試劑的毒性不僅干擾細胞正常的生理狀態(tài)，甚至還可能影響實驗結(jié)果； 方法簡單、操作簡單：越簡單，操作越少的實驗過程，自然出錯的機會就少，重復(fù)性就好，工作量也少； 成本較低：由于siRNA轉(zhuǎn)染需要篩選有效的siRNA，有效siRNA后續(xù)大量研究還需要不斷進行siRNA轉(zhuǎn)染，siRNA

13、轉(zhuǎn)染的成本尤其是轉(zhuǎn)染試劑的成本在實驗開始之初就需要充分考慮。,感謝下載,32,(2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法,到目前為止，轉(zhuǎn)染的方法主要采用化學方法，化學方法不能轉(zhuǎn)染的采用電轉(zhuǎn)化等物理方法。,感謝下載,33,(3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類,脂質(zhì)體類 非脂質(zhì)體聚合物類,感謝下載,34,(4) 脂質(zhì)體,開發(fā)較早，主要針對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA等大分子開發(fā)，現(xiàn)在也被改良用于siRNA的轉(zhuǎn)染； 適合siRNA與質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)以及一些對毒性要求不高的siRNA轉(zhuǎn)染； 代表產(chǎn)品有invitrogen公司的lipofectamineTM 2000/3000和RNAiMAX。,感謝下載,35,(5) 非脂質(zhì)體聚合物類

14、,為克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的毒性，并提高轉(zhuǎn)染效率，現(xiàn)在已從高分子聚合物類轉(zhuǎn)染試劑發(fā)展到納米聚合物類轉(zhuǎn)染試劑。 代表產(chǎn)品有： Merck公司的NanoJuice Transfection Kit（Caco-2）； Qiagen公司的HiperFect； Clontech公司的XfectTM； Micropoly公司的Micropoly-transfecterTM cell reagent； Engreen Biosystem公司的EntransterTM-R等。,感謝下載,36,第三部分siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答,1.siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題 2.siRNA轉(zhuǎn)染疑問解答,感謝下載,37,1.

15、siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題,(1) 轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量的問題 (2) 轉(zhuǎn)染時siRNA工作濃度 (3) 轉(zhuǎn)染時血清的問題 (4) 轉(zhuǎn)染時抗生素的問題 (5) 轉(zhuǎn)染過程 (6) 轉(zhuǎn)染后換液的問題 (7) 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題 (8) RNAi效應(yīng)檢測方法,感謝下載,38,(1) 轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量的問題,細胞數(shù)量：以轉(zhuǎn)染時，細胞的匯合度在20-40為宜，這個匯合度比通常DNA轉(zhuǎn)染的匯合度要小，這是因為轉(zhuǎn)染后需要培養(yǎng)的時間通常比DNA轉(zhuǎn)染的時間要長，同時較低的細胞數(shù)量也有利于提高抑制效率。 需要注意的是：轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度（細胞數(shù)量）會對RNAi結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要的匯合度會高一些，

16、這是為了減輕轉(zhuǎn)染試劑的毒性，一般來說，細胞數(shù)量較少更能提高抑制效率。,感謝下載,39,(2) 轉(zhuǎn)染時siRNA工作濃度,siRNA濃度：需要根據(jù)具體的實驗進行相關(guān)的優(yōu)化。過低的siRNA濃度達不到相應(yīng)的抑制效果，過高的siRNA濃度可能會引起一些非特異的改變。需要注意的是這里siRNA濃度指siRNA在反應(yīng)時的終濃度，也就是以轉(zhuǎn)染時細胞的總體積來計算的。一般siRNA的有效反應(yīng)濃度在10nM-200nM，選擇最低有效濃度。 需要注意的是：siRNA的分子量，對21nt雙鏈siRNA oligo來說，平均分子量約為13300g/mol，合成siRNA其OD值和nmol換算關(guān)系由于OD值受產(chǎn)物中其

17、他成分影響，如熒光標記、純度等，具體請詢問合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。,感謝下載,40,(3) 轉(zhuǎn)染時血清的問題,一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4-6h再更換成有血清培養(yǎng)基，這其實是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細胞毒性。現(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染試劑也能在血清存在下轉(zhuǎn)染。,感謝下載,41,(4) 轉(zhuǎn)染時抗生素的問題,一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要在轉(zhuǎn)染時采用無抗生素培養(yǎng)基，這是由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會同時將培養(yǎng)基的一些成份包括抗生素也帶進細胞，造成細胞毒性。現(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染試劑也不要求去除抗生素。,感謝下載,42,(5) 轉(zhuǎn)染過程,轉(zhuǎn)染過程：轉(zhuǎn)染的過程其實很簡單。一

18、般是分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，然后二者混合，滴加到細胞表面，然后細胞繼續(xù)培養(yǎng)。這點根據(jù)不同轉(zhuǎn)染試劑的Protocol操作即可。,感謝下載,43,(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問題,一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染后4-6h換液，其目的就是去除在培養(yǎng)基中的游離轉(zhuǎn)染試劑，減輕細胞毒性。,感謝下載,44,(7) 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件不僅是為得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低轉(zhuǎn)染各條件對細胞的毒性。 優(yōu)化的方面主要有：轉(zhuǎn)染試劑的用量、siRNA的用量、轉(zhuǎn)染時細胞密度、轉(zhuǎn)染的過程（培養(yǎng)基、抗生素對細胞的影響），轉(zhuǎn)染后細胞多長時間換液等。,感謝下載,45,(8) RNAi效應(yīng)檢測方法,mRNA水平：最簡單和靈敏的檢測方法是用qRT-PCR，一般在轉(zhuǎn)染后24h-48h檢測。 蛋白水平：常見的是Western B