放射免疫技術(shù)ppt課件

1、.,免疫學(xué)檢驗(yàn),.,第十九章 放射免疫技術(shù),.,放射免疫技術(shù)的基本概念及類型 放射標(biāo)記物的鑒定與純化。 RIA和IRMA的測(cè)定原理及關(guān)鍵技術(shù)。 RIA和IRMA的臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià),本章要點(diǎn),.,目錄,.,放射免疫技術(shù)是將放射性核素高敏感的示蹤特點(diǎn)和抗原抗體反應(yīng)的高特異性特點(diǎn)相結(jié)合的一種體外測(cè)定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。 其基本模式是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，通過免疫反應(yīng)進(jìn)行定量測(cè)定。 具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡(jiǎn)便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。 放射免疫技術(shù)根據(jù)其方法學(xué)原理的不同主要有兩種類型：RIA和IRMA。,前 言,.,第一節(jié) 放射性核素和放射

2、性標(biāo)記物的制備,放射性核素作為放射性免疫技術(shù)的標(biāo)記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標(biāo)記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），是建立放射免疫技術(shù)的基礎(chǔ)。,.,一、放射性核素的基本知識(shí),基本概念 指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種 放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時(shí) 釋放射線（、），又稱為放射性衰變。 基本類型 依據(jù)其衰變方式 衰變、衰變、衰變,最常用的放射性核素是125I,.,125I的優(yōu)點(diǎn),化學(xué)性質(zhì)比較活潑，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，且容易獲得 高比活性的標(biāo)記物； 在衰變過程中產(chǎn)生射線，便于測(cè)量且效率高； 半衰期適中（60天左右），且廢棄物較容易處理。,125I的缺點(diǎn),用125I取代H，可

3、能使原物質(zhì)免疫活性受到影響； 易因發(fā)生輻射損傷而使標(biāo)記抗原變性； 作為商品化試劑的產(chǎn)品貨架期較短。,.,放射性核素放射活性的檢測(cè),利用射線照射閃爍體（NaI晶體），導(dǎo)致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時(shí)，閃爍體發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉(zhuǎn)換成光電子并放大107倍；從光電倍增管輸出的電信號(hào)經(jīng)過放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處理，并在定標(biāo)器上顯示。,.,二、放射性核素標(biāo)記抗原抗體方法,主要包括,間接標(biāo)記法,直接標(biāo)記法（氯胺T法）,.,125I-,125I或125I+,125I-標(biāo)記物 （混合物）,Ch-T、LPO氧化,取代反應(yīng),（一）直接標(biāo)記法氯胺T法（Ch-T）,氯胺T將125I的I氧

4、化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標(biāo)記物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亞硫酸鈉（還原劑）終止反應(yīng)。,.,使用無還原劑的高比放射性碘源 被標(biāo)記物用量要少 Ch-T用量要低 控制總反應(yīng)體積200l 反應(yīng)時(shí)間1分鐘2分鐘 弱堿性反應(yīng)條件,.,（二）間接標(biāo)記法,預(yù)先將125I用Ch-T法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基團(tuán)可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。,.,三、放射標(biāo)記物的純化與鑒定,（一）放射標(biāo)記物的純化,因游離的125I與125I標(biāo)記抗原（抗體）分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進(jìn)行分離純化,聚合、損傷物,標(biāo)記蛋白,游離125I,.,比放射活性

5、 高比放射性 高純度 完整免疫活性,放射化學(xué)純度 單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率 應(yīng)大于95%,免疫活性 標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力 標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比 該值越大, 標(biāo)記物免疫活性好,（二）放射標(biāo)記物的鑒定,.,計(jì)算法 自身置換法,比放射活性 單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度 單位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性過高，將影響標(biāo)記物免疫活性,.,比放射性計(jì)算法,結(jié)果欠準(zhǔn)，計(jì)算簡(jiǎn)便,依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）來計(jì)算標(biāo)記物的比放射性.,.,比放射性自身置換法,比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測(cè)定標(biāo)記物的比放射性。,作一條常規(guī)的RIA標(biāo)

6、準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系包括定量標(biāo)記抗原、不同濃度的非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品抗原、限量抗體；同時(shí)另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品、只加抗體和不同劑量的標(biāo)記抗原的自身置換曲線。,.,自身置換曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)平衡后，測(cè)定B/T%。 若從兩條曲線上取一點(diǎn)相同的B/T%，則（標(biāo)記物+標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)準(zhǔn)曲線=（標(biāo)記物） 自身置換曲線。由此便可直接計(jì)算標(biāo)記抗原的含量，并進(jìn)一步求得比放射活性 。,.,自身置換法測(cè)定標(biāo)記化合物的比放射活性，只適用于RIA的標(biāo)記抗原。使用時(shí)應(yīng)注意： 標(biāo)記物與未標(biāo)記物對(duì)抗體（受體）的親和力 應(yīng)相同； 非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除； 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線時(shí)，操作步驟 應(yīng)相同，特別是B與F分離的條件要

7、一致。,.,第二節(jié) 放射免疫分析,放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標(biāo)記的抗原（Ag*）與未標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異抗體（Ab）來對(duì)待檢樣品中的抗原進(jìn)行定量測(cè)定的一種技術(shù)。,.,一、檢測(cè)原理,RIA屬于競(jìng)爭(zhēng)性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待測(cè)物Ag)對(duì)特異性抗體具有相同的結(jié)合力，當(dāng)三者同時(shí)存在于同一反應(yīng)體系時(shí)，Ag*和Ag相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體。 Ag*和Ag具有等同的 與Ab結(jié)合能力,.,Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab結(jié)合位點(diǎn)，二者 通過競(jìng)爭(zhēng)方式與Ab 結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放 射量降低,二者變化 成函數(shù)關(guān)系。,.,(標(biāo)準(zhǔn)A

8、g/樣品Ag),二、方法與類型,非平衡法，即標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標(biāo)記抗原與特異性抗體達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合。,兩種類型,平衡法，即標(biāo)記抗原、標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）、特異性抗體同時(shí)加入反應(yīng)體系中。,.,三、關(guān)鍵技術(shù),抗原抗體反應(yīng),分離結(jié)合標(biāo)記物（分離技術(shù)）,放射性測(cè)定,數(shù)據(jù)處理,.,Ag*,Ag,反應(yīng)條件 體積 溫度 時(shí)間 pH,Ab,(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag),（一）抗原抗體反應(yīng),牢固的抗原抗體復(fù)合物,.,二抗體沉淀法,PEG 沉淀法,PR 試劑法,活性炭吸附法,分離徹底，迅速 分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡 效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響 操作應(yīng)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好

9、 經(jīng)濟(jì),（二）分離結(jié)合標(biāo)記物,.,晶體閃爍計(jì)數(shù)器 包括了NaI閃爍晶 體、光電倍增管 以及計(jì)數(shù)器 測(cè)量的放射性信 號(hào)是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分 鐘計(jì)數(shù)(cpm),參數(shù) cpm B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%),注：T即是B與F的總和,（三）數(shù)據(jù)處理,標(biāo)準(zhǔn)曲線,.,RIA由于具有敏感度高、特異性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好、用血量少、可測(cè)定小分子量和大分子量物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測(cè)定。 但由于放射性核素的放射性對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生一定的危害性，且其廢物的儲(chǔ)存和銷毀會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此操作時(shí)必須加以注意。,四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用,.,第三節(jié) 免

10、疫放射分析,免疫放射分析（IRMA）是從放射免疫分析（RIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核素標(biāo)記免疫測(cè)定，其特點(diǎn)為用核素標(biāo)記的抗體直接與待檢抗原反應(yīng)，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段。,.,一、檢測(cè)原理,IRMA屬于非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)，其基本檢測(cè) 原理是將放射性核素（125I）標(biāo)記在抗體上，并 用過量的標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 反應(yīng)，并采用固相免疫吸附方式對(duì)B和F進(jìn)行分離。 檢測(cè)免疫復(fù)合物的放射性，從而得到待檢樣本的 濃度。,.,二、方法與類型,（一）單位點(diǎn) IRMA,.,（二）雙位點(diǎn) IRMA,.,三、關(guān)鍵技術(shù),抗原抗體反應(yīng),分離技術(shù),放射性測(cè)定,數(shù)據(jù)處理,.,Ab*,Ag,Ab,

11、(待檢Ag),（一）抗原抗體反應(yīng),固相抗原抗體復(fù)合物,*,牢固的抗原抗體復(fù)合物,.,固相吸附分離技術(shù),（二）分離技術(shù),一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預(yù)包被抗體稀釋到3g/ml10g/ml，室溫過夜，棄包被緩沖液（含有未結(jié)合物質(zhì)和過剩標(biāo)記物），并洗滌去掉結(jié)合不牢固抗體，從而達(dá)到分離的目的；然后，再加入1%牛血清白蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆谩?.,晶體閃爍計(jì)數(shù)器 包括了NaI閃爍晶 體、光電倍增管 以及計(jì)數(shù)器 測(cè)量的放射性信 號(hào)是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分 鐘計(jì)數(shù)(cpm),參數(shù) cpm B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%),注：T即是B與F的總和,（三）數(shù)據(jù)處理,.,IRMA的優(yōu)點(diǎn) 效率高、操作簡(jiǎn)便 靈敏度高 特異型強(qiáng) 穩(wěn)定性好,四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用,IRMA的缺點(diǎn) 抗體用量較多 抗體的純化較難,RMA的測(cè)定對(duì)象主要限于有兩個(gè)以上抗原決定簇的肽類或蛋白質(zhì)。抗體適用于大分子蛋白質(zhì)和多肽類激素的檢測(cè)分析，如腫瘤標(biāo)志物CA15-3，人血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、降鈣素、HBsAg等，某些難以標(biāo)記的病毒抗原也可通過IRMA進(jìn)行檢測(cè)。,.,小 結(jié),放射免疫技術(shù)是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，通過免疫